إعادة بناء خلية واحدة توقيعات الفلورية الفطرية من قبل المجهر Confocal
Summary
هنا، يتم تقديم بروتوكول لاستخراج بصريا وفهرسة التوقيعات الفلورية الخلوية الفطرية (أي، autofluorescence الخلوية) من كل خلية حية الفردية الموزعة في الفضاء ثلاثي الأبعاد. هذه الطريقة مناسبة لدراسة التوقيع الفلوري الفطري للأنظمة البيولوجية المتنوعة بدقة خلية واحدة ، بما في ذلك خلايا من البكتيريا والفطريات والخمائر والنباتات والحيوانات.
Abstract
الموصوفة هنا هو انعكاس الكونفوكوكال بمساعدة المجهر خلية واحدة تحليل الفلورية الفطرية (CRIF)، وهي طريقة طفيفة التوغل لإعادة بناء التوقيع الفلوري الخلوية الفطرية من كل خلية حية فردية في السكان موزعة في مساحة ثلاثية الأبعاد (3D). التوقيع الفلوري الفطري للخلية هو مجموعة من إشارات الفلورسينس المنبعثة من الجزيئات الحيوية المختلفة داخل الخلية. أثبتت الدراسات السابقة أن توقيعات الفلورسينس الفطرية تعكس مختلف الخصائص الخلوية والاختلافات في الحالة الفسيولوجية وهي مصدر غني للمعلومات لتحديد خصائص الخلايا وتحديدها. وقد تم تحليل التوقيعات الفلورية الفطرية تقليديا على مستوى السكان، مما استلزم ثقافة التخفي، ولكن ليس على مستوى الخلية الواحدة. CRIF مناسبة بشكل خاص للدراسات التي تتطلب دقة ثلاثية الأبعاد و / أو استخراج انتقائي للإشارات الفلورية من الخلايا الفردية. ولأن التوقيع الفلوري هو خاصية فطرية للخلية، فإن CRIF مناسب أيضا للتنبؤ الخالي من العلامات بنوع و/أو الحالة الفسيولوجية للخلايا السليمة والخلايا المفردة. قد تكون هذه الطريقة أداة قوية لتحليل الخلايا المبسطة ، حيث يمكن تقييم النمط الظاهري لكل خلية واحدة في مجموعة غير متجانسة مباشرة من خلال توقيعها autofluorescence تحت المجهر دون وضع علامات على الخلية.
Introduction
تنبعث من الجزيئات الحيوية المتنوعة داخل الخلية 1 إشارات الفلورة الذاتية ، ويتكون التوقيع الفلوري الفطري للخلية من تجميع هذه الإشارات. يعكس هذا التألق المميز خصائص خلوية مختلفة وكذلك اختلافات في الحالة الفسيولوجية. تحليل الفلورسينس الفطرية هو الحد الأدنى من الغازية ويمكن أن تكمل التقليدية، والتحقيقات الميكروبيولوجية أكثر الغازية التي تترك مجموعة من الآثار من تعديل التمثيل الغذائي المعتدل لتدمير الخلايا كاملة. في حين أن التقنيات التقليدية مثل الحمض النووي أو استخراج محتوى الخلية2،3 ، الفلورسنت في التهجين الموقع4 ، وإدخال جينات المراسل الفلوري إلى الجينوم فعالة في تحديد نوع الخلية أو الحالة الفسيولوجية ، فإنها تتطلب عادة إما التلاعب بالخلايا أو وضع علامات غازية.
وقد أظهرت الدراسات التي أجريت على الفلورة الفطرية لمختلف المستعمرات الميكروبية الحية وسليمة، بما في ذلك تعليق الاستزراع الميكروبي السائب5،6، والحمأة النشطة7، وأنسجة الثدييات8،9، وخلايا الثدييات1،10، أن تحليل الفلورسنت الفطري يسهل التحليل الخالي من العلامات لأنواع الخلايا والحالة الفسيولوجية. وقد تم تقليديا تحليل التوقيعات الفلورية الفطرية على مستوى السكان وليس على مستوى الخلية الواحدة ، وبالتالي تتطلب ثقافة التخفي. في المقابل ، فإن تقنية تحليل التوهج البؤري confocal بمساعدة المجهر وحيدة الخلية innate fluorescence (CRIF) التقنية11 الموصوفة هنا تعيد بناء وفهرسة التوقيع الفلوري الخلوي الفطري لكل خلية ميكروبية حية فردية. وعلاوة على ذلك، يمكن ل CRIF أن تجمع بشكل منهجي التوقيع الفلوري الفطري لخلية ميكروبية واحدة داخل مجموعة يتم توزيعها في مساحة ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد).
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك نقطتان حاسمتان في هذه الطريقة التي تحتاج إلى متابعة عن كثب للحصول على نتائج قابلة للاستنساخ: 1) الحفاظ على إخراج طاقة الليزر تحت هدف المجهر متسقة من خلال أطوال الموجات والتجارب الإثارة، و 2) إجراء تجزئة دقيقة للخلايا.
النقطة الأولى مهمة بشكل خاص عند مقارنة التوقيع الفلو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذه الدراسة جزئيا بمنحة في المعونة للبحث العلمي من وزارة التعليم والثقافة والرياضة والتكنولوجيا في اليابان (18K04843) إلى Y. Yawata، وJST ERATO (JPMJER1502) إلى ن. نومورا.
Materials
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
References
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
- Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).
- Amman, R., Fuchs, B. M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).
- Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis. Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).
- Leblanc, L., Dufour, E. Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence. FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).
- Hou, X., Liu, S., Feng, Y. The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor. Scientific Reports. 7, 39289 (2017).
- Ramanujam, N., et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence. Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).
- Zhang, J. C., et al. Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).
- Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Scientific Reports. 6, 23453 (2016).
- Yawata, Y., et al. Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell. Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).
- Nelson, K. E., et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems. Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).
- Yawata, Y., et al. Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy. Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition. , (2006).
- Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461 (2014).
