Rekonstruktion af enkeltcellede medfødte fluorescenssignaturer af konfokal mikroskopi
Summary
Her præsenteres en protokol til optisk udvinding og katalogisering af medfødte cellulære fluorescenssignaturer (dvs. cellulær autofluorescence) fra hver enkelt levende celle fordelt i et tredimensionelt rum. Denne metode er velegnet til at studere den medfødte fluorescenssignatur af forskellige biologiske systemer ved en enkeltcellet opløsning, herunder celler fra bakterier, svampe, gær, planter og dyr.
Abstract
Beskrevet her er konfokal refleksion mikroskopi-assisteret single-celle medfødt fluorescens analyse (CRIF), en minimalt invasiv metode til rekonstruktion af den medfødte cellulære fluorescens signatur fra hver enkelt levende celle i en befolkning fordelt i en tre-dimensionel (3D) rum. Den medfødte fluorescens signatur af en celle er en samling af fluorescens signaler udsendes af forskellige biomolekyler i cellen. Tidligere undersøgelser fastslog, at medfødte fluorescenssignaturer afspejler forskellige cellulære egenskaber og forskelle i fysiologisk status og er en rig informationskilde til cellekarakterisering og identifikation. Medfødte fluorescenssignaturer er traditionelt blevet analyseret på befolkningsniveau, hvilket nødvendiggør en klonisk kultur, men ikke på encellet niveau. CRIF er særligt velegnet til undersøgelser, der kræver 3D-opløsning og/eller selektiv udvinding af fluorescenssignaler fra de enkelte celler. Fordi fluorescenssignaturen er en medfødt egenskab af en celle, er CRIF også velegnet til tagfri forudsigelse af typen og / eller fysiologisk status for intakte og enkelte celler. Denne metode kan være et kraftfuldt værktøj til strømlinet celleanalyse, hvor fænotypen for hver enkelt celle i en heterogen population kan vurderes direkte ved sin autofluorescence signatur under et mikroskop uden cellemærkning.
Introduction
Forskellige biomolekyler i en celle1 udsender autofluorescence signaler, og den medfødte fluorescens signatur af en celle består af samlingen af disse signaler. Denne signatur fluorescens afspejler forskellige cellulære egenskaber og også forskelle i fysiologisk status. Analyse af medfødt fluorescens er minimalt invasiv og kan supplere traditionelle, mere invasive mikrobiologiske sonder, der efterlader en række spor fra mild metabolisk modifikation til fuldstændig celledestruktion. Mens traditionelle teknikker såsom DNA eller celleindhold ekstraktion2,3, fluorescerende in situ hybridisering4, og indførelsen af fluorescerende reporter gener til genomet er effektive til at bestemme celletype eller fysiologisk status, de almindeligvis kræver enten manipulation af cellerne eller invasive mærkning.
Undersøgelser af medfødt fluorescens af forskellige levende og intakte mikrobielle kolonier, herunder bulk mikrobielle kultur suspensioner5,6, aktiv slam7, pattedyr væv8,9, og pattedyr celler1,10, har vist, at medfødt fluorescens analyse letter tag-fri analyse af celletyper og fysiologisk status. Medfødte fluorescenssignaturer er traditionelt blevet analyseret på befolkningsniveau og ikke på enkeltcelleniveau og kræver dermed en klonisk kultur. I modsætning hertil rekonstruerer og katalogiserer den confokale reflection-mikroskopi-assisteret enkeltcellet innat fluorescence-teknik (CRIF), der er beskrevet her, den medfødte cellulære fluorescenssignatur for hver enkelt levende mikrobiel celle. Desuden kan CRIF systematisk samle den medfødte fluorescenssignatur for en enkelt mikrobiel celle i en population, der er fordelt i et tredimensionelt (3D) rum.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der er to kritiske punkter i denne metode, der skal følges nøje for at opnå reproducerbare resultater: 1) holde laser effekt under mikroskop mål konsekvent gennem excitation bølgelængder og eksperimenter, og 2) udføre nøjagtige celle segmentering.
Det første punkt er særlig vigtigt, når man sammenligner den medfødte fluorescenssignatur mellem forskellige eksperimenter. Undgå blot at anvende de samme “procent output” indstillinger til excitation bølgelængder (dvs. ved hjælp af 5…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev delvist støttet af et tilskud til videnskabelig forskning fra Japans ministerium for uddannelse, kultur, sport og teknologi (18K04843) til Y. Yawata, JST ERATO (JPMJER1502) til N. Nomura.
Materials
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
References
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
- Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).
- Amman, R., Fuchs, B. M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).
- Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis. Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).
- Leblanc, L., Dufour, E. Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence. FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).
- Hou, X., Liu, S., Feng, Y. The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor. Scientific Reports. 7, 39289 (2017).
- Ramanujam, N., et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence. Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).
- Zhang, J. C., et al. Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).
- Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Scientific Reports. 6, 23453 (2016).
- Yawata, Y., et al. Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell. Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).
- Nelson, K. E., et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems. Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).
- Yawata, Y., et al. Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy. Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition. , (2006).
- Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461 (2014).
