Rekonstruktion von einzelligen angeborenen Fluoreszenzsignaturen durch konfokale Mikroskopie
Summary
Hier wird ein Protokoll zur optischen Extraktion und Katalogisierung angeborener zellulärer Fluoreszenzsignaturen (d.h. zelluläre Autofluoreszenz) aus jeder einzelnen lebenden Zelle vorgestellt, die in einem dreidimensionalen Raum verteilt ist. Diese Methode eignet sich, um die angeborene Fluoreszenzsignatur verschiedener biologischer Systeme mit einzelliger Auflösung zu untersuchen, einschließlich Zellen von Bakterien, Pilzen, Hefen, Pflanzen und Tieren.
Abstract
Beschrieben wird hier die konfokale Reflexionsmikroskopie-assistierte Einzelzell-Angeborenenfluoreszenzanalyse (CRIF), eine minimal-invasive Methode zur Rekonstruktion der angeborenen zellulären Fluoreszenzsignatur jeder einzelnen lebenden Zelle in einer Population, die in einem dreidimensionalen (3D) Raum verteilt ist. Die angeborene Fluoreszenzsignatur einer Zelle ist eine Sammlung von Fluoreszenzsignalen, die von verschiedenen Biomolekülen innerhalb der Zelle emittiert werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass angeborene Fluoreszenzsignaturen verschiedene zelluläre Eigenschaften und Unterschiede im physiologischen Status widerspiegeln und eine reichhaltige Informationsquelle für die Zellcharakterisierung und -identifizierung darstellen. Angeborene Fluoreszenzsignaturen wurden traditionell auf Populationsebene analysiert, was eine klonale Kultur erforderte, aber nicht auf Einzelzellebene. CRIF eignet sich besonders für Studien, die eine 3D-Auflösung und/oder selektive Extraktion von Fluoreszenzsignalen einzelner Zellen erfordern. Da die Fluoreszenzsignatur eine angeborene Eigenschaft einer Zelle ist, eignet sich CRIF auch zur tagfreien Vorhersage des Typs und/oder physiologischen Status intakter und einzelner Zellen. Diese Methode kann ein leistungsfähiges Werkzeug für die optimierte Zellanalyse sein, bei der der Phänotyp jeder einzelnen Zelle in einer heterogenen Population direkt durch ihre Autofluoreszenzsignatur unter einem Mikroskop ohne Zellmarkierung beurteilt werden kann.
Introduction
Verschiedene Biomoleküle innerhalb einer Zelle1 emittieren Autofluoreszenzsignale, und die angeborene Fluoreszenzsignatur einer Zelle besteht aus der Anordnung dieser Signale. Diese charakteristische Fluoreszenz spiegelt verschiedene zelluläre Eigenschaften und auch Unterschiede im physiologischen Status wider. Die Analyse der angeborenen Fluoreszenz ist minimal-invasiv und kann traditionelle, invasivere mikrobiologische Sonden ergänzen, die eine Reihe von Spuren von leichter metabolischer Modifikation bis hin zur vollständigen Zellzerstörung hinterlassen. Während traditionelle Techniken wie die Extraktion von DNA- oder Zellinhalten2,3, die fluoreszierende In-situ-Hybridisierung4 und die Einführung fluoreszierender Reportergene in das Genom bei der Bestimmung des Zelltyps oder des physiologischen Status wirksam sind, erfordern sie in der Regel entweder eine Manipulation der Zellen oder eine invasive Markierung.
Studien zur angeborenen Fluoreszenz verschiedener lebender und intakter mikrobieller Kolonien, einschließlich mikrobieller Kultursuspensionen5,6, aktiver Schlämme7, Säugetiergewebe8,9 und Säugetierzellen1,10, haben gezeigt, dass die angeborene Fluoreszenzanalyse eine tagfreie Analyse von Zelltypen und physiologischem Status erleichtert. Angeborene Fluoreszenzsignaturen wurden traditionell auf Populationsebene und nicht auf Einzelzellebene analysiert und erfordern daher eine klonale Kultur. Im Gegensatz dazu rekonstruiert und katalogisiert die hier beschriebene confokale Reflection microscopy-assisted single cell innate fluorescence analysis (CRIF)-Technik11 die angeborene zelluläre Fluoreszenzsignatur jeder einzelnen lebenden mikrobiellen Zelle. Darüber hinaus kann CRIF systematisch die angeborene Fluoreszenzsignatur einer einzelnen mikrobiellen Zelle innerhalb einer Population sammeln, die in einem dreidimensionalen (3D) Raum verteilt ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt zwei kritische Punkte in dieser Methode, die genau verfolgt werden müssen, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten: 1) Halten Sie die Laserleistung unter dem Mikroskopobjektiv durch Anregungswellenlängen und Experimente konsistent und 2) führen Sie eine genaue Zellsegmentierung durch.
Der erste Punkt ist besonders wichtig, wenn man die angeborene Fluoreszenzsignatur zwischen verschiedenen Experimenten vergleicht. Vermeiden Sie es, einfach die gleichen “prozentualen Ausgangseinstel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde zum Teil durch einen Zuschuss für die wissenschaftliche Forschung des japanischen Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport und Technologie (18K04843) an Y. Yawata, den JST ERATO (JPMJER1502) an N. Nomura unterstützt.
Materials
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
References
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