Confocal माइक्रोस्कोपी द्वारा एकल सेल जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर का पुनर्निर्माण
Summary
यहां, एक प्रोटोकॉल ऑप्टिकल रूप से निकालने और जन्मजात सेलुलर प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर (यानी, सेलुलर ऑटोफ्लोरेसेंस) को तीन आयामी स्थान में वितरित प्रत्येक व्यक्ति लाइव सेल से कैटलॉग करने के लिए प्रस्तुत किया गया है। यह विधि एक एकल-कोशिका संकल्प पर विविध जैविक प्रणालियों के जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है, जिसमें बैक्टीरिया, कवक, खमीर, पौधों और जानवरों से कोशिकाएं शामिल हैं।
Abstract
यहां वर्णित confocal प्रतिबिंब माइक्रोस्कोपी-सहायता प्राप्त एकल-सेल जन्मजात प्रतिदीप्ति विश्लेषण (CRIF) है, जो तीन आयामी (3 डी) अंतरिक्ष में वितरित आबादी में प्रत्येक व्यक्तिगत लाइव सेल से जन्मजात सेलुलर प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर के पुनर्निर्माण के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव विधि है। एक सेल का जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर सेल के भीतर विभिन्न बायोमोलेक्यूल्स द्वारा उत्सर्जित प्रतिदीप्ति संकेतों का एक संग्रह है। पिछले अध्ययनों ने स्थापित किया कि जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर विभिन्न सेलुलर गुणों और शारीरिक स्थिति में अंतर को दर्शाते हैं और सेल लक्षण वर्णन और पहचान के लिए जानकारी का एक समृद्ध स्रोत हैं। जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर पारंपरिक रूप से जनसंख्या स्तर पर विश्लेषण किया गया है, एक क्लोनल संस्कृति की आवश्यकता है, लेकिन एकल-सेल स्तर पर नहीं। सीआरआईएफ उन अध्ययनों के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है जिनके लिए 3 डी रिज़ॉल्यूशन और / या व्यक्तिगत कोशिकाओं से प्रतिदीप्ति संकेतों के चयनात्मक निष्कर्षण की आवश्यकता होती है। क्योंकि प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर एक सेल की एक जन्मजात संपत्ति है, CRIF भी बरकरार और एकल कोशिकाओं के प्रकार और / या शारीरिक स्थिति के टैग-मुक्त पूर्वानुमान के लिए उपयुक्त है। यह विधि सुव्यवस्थित सेल विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकती है, जहां एक विषम आबादी में प्रत्येक एकल सेल के फेनोटाइप का मूल्यांकन सीधे सेल टैगिंग के बिना माइक्रोस्कोप के तहत इसके ऑटोफ्लोरेसेंस हस्ताक्षर द्वारा किया जा सकता है।
Introduction
एक सेल 1 के भीतर विविध बायोमोलेक्यूल्स ऑटोफ्लोरेसेंस संकेतों का उत्सर्जन करते हैं, और एक सेल के जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर में इन संकेतों की असेंबली होती है। यह हस्ताक्षर प्रतिदीप्ति विभिन्न सेलुलर गुणों और शारीरिक स्थिति में अंतर को भी दर्शाता है। जन्मजात प्रतिदीप्ति का विश्लेषण न्यूनतम इनवेसिव है और पारंपरिक, अधिक आक्रामक सूक्ष्मजीवविज्ञानी जांच के पूरक हो सकता है जो पूर्ण सेल विनाश के लिए हल्के चयापचय संशोधन से निशान की एक श्रृंखला छोड़ देते हैं। जबकि डीएनए या सेल सामग्री निष्कर्षण 2,3, फ्लोरोसेंट इन सीटू संकरण 4, और जीनोम में फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन की शुरूआत जैसी पारंपरिक तकनीकें सेल प्रकार या शारीरिक स्थिति को निर्धारित करने में प्रभावी हैं, उन्हें आमतौर पर या तो कोशिकाओं के हेरफेर या आक्रामक टैगिंग की आवश्यकता होती है।
थोक माइक्रोबियल संस्कृति निलंबन 5,6, सक्रिय sludges7, स्तनधारी ऊतक8,9, और स्तनधारी कोशिकाओं 1,10 सहित विभिन्न जीवित और बरकरार माइक्रोबियल कॉलोनियों के जन्मजात प्रतिदीप्ति के अध्ययन से पता चला है कि जन्मजात प्रतिदीप्ति विश्लेषण सेल प्रकार और शारीरिक स्थिति के टैग-मुक्त विश्लेषण की सुविधा प्रदान करता है। जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर पारंपरिक रूप से जनसंख्या स्तर पर विश्लेषण किया गया है और एकल-सेल स्तर पर नहीं, और इस प्रकार एक क्लोनल संस्कृति की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, यहां वर्णित कोनफोकल रिफ्लेक्शन माइक्रोस्कोपी-असिस्टेड सिंगल-सेल इनेट फ्लुओरेसेंस विश्लेषण (सीआरआईएफ) तकनीक 11 प्रत्येक व्यक्ति के जीवित माइक्रोबियल सेल के जन्मजात सेलुलर प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर का पुनर्निर्माण और कैटलॉग करती है। इसके अलावा, सीआरआईएफ व्यवस्थित रूप से एक आबादी के भीतर एक एकल माइक्रोबियल सेल के जन्मजात प्रतिदीप्ति हस्ताक्षर को व्यवस्थित रूप से एकत्र कर सकता है जिसे तीन आयामी (3 डी) स्थान में वितरित किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस विधि में दो महत्वपूर्ण बिंदु हैं जिन्हें पुन: प्रस्तुत करने योग्य परिणाम प्राप्त करने के लिए बारीकी से पालन करने की आवश्यकता है: 1) माइक्रोस्कोप उद्देश्य के तहत लेजर पावर आउटपुट को उत्तेजना तरंग दैर?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को जापान के शिक्षा, संस्कृति, खेल और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (18K04843) से वैज्ञानिक अनुसंधान के लिए अनुदान-सहायता द्वारा भाग में समर्थित किया गया था, जो कि JST ERATO (JPMJER1502) से N. Nomura के लिए Y. Yawata को दिया गया था।
Materials
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
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