Ricostruzione delle firme di fluorescenza innata unicellulare mediante microscopia confocale
Summary
Qui, viene presentato un protocollo per estrarre otticamente e catalogare le firme di fluorescenza cellulare innata (cioè l’autofluorescenza cellulare) da ogni singola cellula viva distribuita in uno spazio tridimensionale. Questo metodo è adatto per studiare la firma di fluorescenza innata di diversi sistemi biologici a una risoluzione unicellulare, comprese le cellule di batteri, funghi, lieviti, piante e animali.
Abstract
Qui è descritta l’analisi di fluorescenza innata a singola cellula assistita da microscopia a riflessione confocale (CRIF), un metodo minimamente invasivo per ricostruire la firma di fluorescenza cellulare innata da ogni singola cellula viva in una popolazione distribuita in uno spazio tridimensionale (3D). La firma di fluorescenza innata di una cellula è una raccolta di segnali di fluorescenza emessi da varie biomolecole all’interno della cellula. Studi precedenti hanno stabilito che le firme di fluorescenza innata riflettono varie proprietà cellulari e differenze nello stato fisiologico e sono una ricca fonte di informazioni per la caratterizzazione e l’identificazione cellulare. Le firme di fluorescenza innata sono state tradizionalmente analizzate a livello di popolazione, rendendo necessaria una coltura clonale, ma non a livello di singola cellula. Il CRIF è particolarmente indicato per studi che richiedono risoluzione 3D e/o estrazione selettiva di segnali di fluorescenza da singole cellule. Poiché la firma di fluorescenza è una proprietà innata di una cellula, il CRIF è adatto anche per la previsione senza tag del tipo e/o dello stato fisiologico di cellule intatte e singole. Questo metodo può essere un potente strumento per l’analisi cellulare semplificata, in cui il fenotipo di ogni singola cellula in una popolazione eterogenea può essere valutato direttamente dalla sua firma di autofluorescenza al microscopio senza marcatura cellulare.
Introduction
Diverse biomolecole all’interno di una cellula1 emettono segnali di autofluorescenza e la firma di fluorescenza innata di una cellula consiste nell’assemblaggio di questi segnali. Questa fluorescenza distintiva riflette varie proprietà cellulari e anche differenze nello stato fisiologico. L’analisi della fluorescenza innata è minimamente invasiva e può integrare le sonde microbiologiche tradizionali e più invasive che lasciano una serie di tracce dalla lieve modificazione metabolica alla completa distruzione cellulare. Mentre le tecniche tradizionali come l’estrazione del DNA o del contenuto cellulare2,3, l’ibridazione fluorescente in situ4 e l’introduzione di geni reporter fluorescenti nel genoma sono efficaci nel determinare il tipo di cellula o lo stato fisiologico, comunemente richiedono la manipolazione delle cellule o l’etichettatura invasiva.
Studi sulla fluorescenza innata di varie colonie microbiche vive e intatte, tra cui sospensioni di colture microbiche sfuse5,6, fanghi attivi7, tessuti di mammiferi8,9 e cellule di mammifero1,10, hanno dimostrato che l’analisi della fluorescenza innata facilita l’analisi senza tag dei tipi cellulari e dello stato fisiologico. Le firme di fluorescenza innata sono state tradizionalmente analizzate a livello di popolazione e non a livello di singola cellula, e quindi richiedono una coltura clonale. Al contrario, la tecnica di analisi della fluorescenza dell’innato a singola cellula assistita da microscopia a reflezione confocale11 qui descritta ricostruisce e cataloga la firma di fluorescenza cellulare innata di ogni singola cellula microbica viva. Inoltre, CRIF può raccogliere sistematicamente la firma di fluorescenza innata di una singola cellula microbica all’interno di una popolazione distribuita in uno spazio tridimensionale (3D).
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono due punti critici in questo metodo che devono essere seguiti da vicino per ottenere risultati riproducibili: 1) mantenere coerente la potenza del laser sotto l’obiettivo del microscopio attraverso lunghezze d’onda di eccitazione ed esperimenti e 2) eseguire un’accurata segmentazione cellulare.
Il primo punto è particolarmente importante quando si confronta la firma di fluorescenza innata tra diversi esperimenti. Evita di applicare semplicemente le stesse impostazioni di “uscita percen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato sostenuto in parte da una sovvenzione per la ricerca scientifica dal Ministero dell’Istruzione, della Cultura, dello Sport e della Tecnologia del Giappone (18K04843) a Y. Yawata, dal JST ERATO (JPMJER1502) a N. Nomura.
Materials
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
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