Rekonstruksjon av enkeltcellede medfødte fluorescenssignaturer ved konfektmikroskopi
Summary
Her presenteres en protokoll for optisk utpakking og katalogisering av medfødte cellulære fluorescenssignaturer (dvs. cellulær autofluorescens) fra hver enkelt levende celle distribuert i et tredimensjonalt rom. Denne metoden er egnet for å studere den medfødte fluorescenssignaturen til forskjellige biologiske systemer med en encellet oppløsning, inkludert celler fra bakterier, sopp, gjær, planter og dyr.
Abstract
Beskrevet her er confocal reflection microscopy-assistert encellet medfødt fluorescensanalyse (CRIF), en minimalt invasiv metode for å rekonstruere den medfødte cellulære fluorescenssignaturen fra hver enkelt levende celle i en populasjon fordelt i et tredimensjonalt (3D) rom. Den medfødte fluorescenssignaturen til en celle er en samling fluorescenssignaler som slippes ut av ulike biomolekyler i cellen. Tidligere studier fastslått at medfødte fluorescenssignaturer gjenspeiler ulike cellulære egenskaper og forskjeller i fysiologisk status og er en rik kilde til informasjon for cellekarakterisering og identifikasjon. Medfødte fluorescenssignaturer har tradisjonelt blitt analysert på befolkningsnivå, noe som nødvendiggjør en klonær kultur, men ikke på encellet nivå. CRIF er spesielt egnet for studier som krever 3D-oppløsning og/eller selektiv utvinning av fluorescenssignaler fra enkeltceller. Fordi fluorescenssignaturen er en medfødt egenskap for en celle, er CRIF også egnet for tagfri prediksjon av typen og / eller fysiologisk status for intakte og enkeltceller. Denne metoden kan være et kraftig verktøy for strømlinjeformet celleanalyse, der fenotypen til hver enkelt celle i en heterogen populasjon kan vurderes direkte av sin autofluorescence signatur under et mikroskop uten cellemerking.
Introduction
Ulike biomolekyler i en celle1 avgir autofluorescenssignaler, og den medfødte fluorescenssignaturen til en celle består av montering av disse signalene. Denne signaturfluorescensen gjenspeiler ulike cellulære egenskaper og også forskjeller i fysiologisk status. Analyse av medfødt fluorescens er minimalt invasiv og kan utfylle tradisjonelle, mer invasive mikrobiologiske sonder som etterlater en rekke spor fra mild metabolsk modifikasjon til fullstendig celleødeleggelse. Mens tradisjonelle teknikker som DNA eller celleinnhold ekstraksjon2,3, fluorescerende in situ hybridisering4, og innføring av fluorescerende reporter gener til genomet er effektive i å bestemme celletype eller fysiologisk status, krever de vanligvis enten manipulering av cellene eller invasiv merking.
Studier av medfødt fluorescens av ulike levende og intakte mikrobielle kolonier, inkludert bulk mikrobielle kultur suspensjoner5,6, aktive slam7, pattedyr vev8,9, og pattedyr celler1,10, har vist at medfødt fluorescens analyse letter tag-fri analyse av celletyper og fysiologisk status. Medfødte fluorescenssignaturer har tradisjonelt blitt analysert på befolkningsnivå og ikke på encellet nivå, og krever dermed en klonærkultur. Derimot, den confokal reflection mikroskopi-assistert encellet innate fluorescence analyse (CRIF) teknikk11 beskrevet her rekonstruerer og kataloger den medfødte cellulær fluorescens signatur av hver enkelt levende mikrobiell celle. Videre kan CRIF systematisk samle den medfødte fluorescenssignaturen til en enkelt mikrobiell celle i en populasjon som er fordelt i et tredimensjonalt (3D) rom.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det er to kritiske punkter i denne metoden som må følges nøye for å oppnå reproduserbare resultater: 1) holde lasereffekten under mikroskopmålet konsistent gjennom eksitasjonsbølgelengder og eksperimenter, og 2) utføre nøyaktig cellesegmentering.
Det første punktet er spesielt viktig når man sammenligner den medfødte fluorescenssignaturen mellom forskjellige eksperimenter. Unngå bare å bruke de samme “prosentutgangsinnstillingene” på eksitasjonsbølgelengdene (dvs. ved å bruke …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble delvis støttet av et bistandsstipend for vitenskapelig forskning fra Departementet for utdanning, kultur, sport og teknologi i Japan (18K04843) til Y. Yawata, JST ERATO (JPMJER1502) til N. Nomura.
Materials
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
References
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
- Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).
- Amman, R., Fuchs, B. M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).
- Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis. Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).
- Leblanc, L., Dufour, E. Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence. FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).
- Hou, X., Liu, S., Feng, Y. The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor. Scientific Reports. 7, 39289 (2017).
- Ramanujam, N., et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence. Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).
- Zhang, J. C., et al. Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).
- Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Scientific Reports. 6, 23453 (2016).
- Yawata, Y., et al. Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell. Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).
- Nelson, K. E., et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems. Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).
- Yawata, Y., et al. Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy. Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition. , (2006).
- Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461 (2014).
