Реконструкция одноклеточных врожденных флуоресцентных сигнатур с помощью конфокальной микроскопии
Summary
Здесь представлен протокол для оптического извлечения и каталогизации врожденных клеточных флуоресцентных сигнатур (т.е. клеточной автофлуоресценции) от каждой отдельной живой клетки, распределенной в трехмерном пространстве. Этот метод подходит для изучения врожденной флуоресцентной сигнатуры различных биологических систем с одноклеточным разрешением, включая клетки бактерий, грибов, дрожжей, растений и животных.
Abstract
Здесь описан конфокальный отражательный микроскопический анализ одноклеточной врожденной флуоресценции (CRIF), минимально инвазивный метод реконструкции врожденной клеточной флуоресцентной сигнатуры от каждой отдельной живой клетки в популяции, распределенной в трехмерном (3D) пространстве. Врожденная флуоресцентная сигнатура клетки представляет собой набор флуоресцентных сигналов, излучаемых различными биомолекулами внутри клетки. Предыдущие исследования установили, что врожденные флуоресцентные сигнатуры отражают различные клеточные свойства и различия в физиологическом статусе и являются богатым источником информации для характеристики и идентификации клеток. Врожденные флуоресцентные сигнатуры традиционно анализируются на популяционном уровне, что требует клональной культуры, но не на уровне одной клетки. CRIF особенно подходит для исследований, которые требуют 3D-разрешения и / или селективного извлечения флуоресцентных сигналов из отдельных клеток. Поскольку флуоресцентная сигнатура является врожденным свойством клетки, CRIF также подходит для безметочного прогнозирования типа и/или физиологического статуса интактных и одиночных клеток. Этот метод может быть мощным инструментом для упрощенного анализа клеток, где фенотип каждой отдельной клетки в гетерогенной популяции может быть непосредственно оценен по ее автофлуоресцентной сигнатуре под микроскопом без маркировки клеток.
Introduction
Разнообразные биомолекулы внутри ячейки1 излучают автофлуоресцентные сигналы, и врожденная флуоресцентная сигнатура клетки состоит из сборки этих сигналов. Эта сигнатурная флуоресценция отражает различные клеточные свойства, а также различия в физиологическом статусе. Анализ врожденной флуоресценции является минимально инвазивным и может дополнять традиционные, более инвазивные микробиологические зонды, которые оставляют ряд следов от легкой метаболической модификации до полного разрушения клеток. Хотя традиционные методы, такие как извлечение ДНК или содержимого клеток2,3, флуоресцентная гибридизация in situ4 и введение флуоресцентных репортерных генов в геном, эффективны в определении типа клеток или физиологического статуса, они обычно требуют либо манипуляций с клетками, либо инвазивной маркировки.
Исследования врожденной флуоресценции различных живых и интактных микробных колоний, включая объемные суспензии микробных культур5,6, активные ила7, ткани млекопитающих8,9 и клетки млекопитающих1,10, показали, что анализ врожденной флуоресценции облегчает анализ типов клеток и физиологического статуса без меток. Врожденные флуоресцентные сигнатуры традиционно анализируются на уровне популяции, а не на уровне одной клетки, и, таким образом, требуют клональной культуры. В отличие от этого, метод анализа одноклеточной флюоресценции (CRIF) с помощью конфокальной рифлекционной микроскопии11, описанный здесь, реконструирует и каталогизирует врожденную клеточную флуоресцентную сигнатуру каждой отдельной живой микробной клетки. Кроме того, CRIF может систематически сопоставлять врожденную флуоресцентную сигнатуру одной микробной клетки в популяции, которая распределена в трехмерном (3D) пространстве.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом методе есть две критические точки, которые необходимо внимательно соблюдать для получения воспроизводимых результатов: 1) поддерживать постоянную выходную мощность лазера под микроскопом с помощью длин волн возбуждения и экспериментов и 2) выполнять точную сегментацию клеток.</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было частично поддержано грантом на научные исследования от Министерства образования, культуры, спорта и технологий Японии (18K04843) Ю. Явате, JST ERATO (JPMJER1502) до Н. Номуры.
Materials
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
References
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
- Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).
- Amman, R., Fuchs, B. M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).
- Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis. Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).
- Leblanc, L., Dufour, E. Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence. FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).
- Hou, X., Liu, S., Feng, Y. The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor. Scientific Reports. 7, 39289 (2017).
- Ramanujam, N., et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence. Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).
- Zhang, J. C., et al. Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).
- Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Scientific Reports. 6, 23453 (2016).
- Yawata, Y., et al. Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell. Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).
- Nelson, K. E., et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems. Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).
- Yawata, Y., et al. Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy. Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition. , (2006).
- Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461 (2014).
