Reconstrucción de firmas de fluorescencia innata unicelular mediante microscopía confocal
Summary
Aquí, se presenta un protocolo para extraer y catalogar ópticamente firmas de fluorescencia celular innata (es decir, autofluorescencia celular) de cada célula viva individual distribuida en un espacio tridimensional. Este método es adecuado para estudiar la firma de fluorescencia innata de diversos sistemas biológicos a una resolución de una sola célula, incluidas las células de bacterias, hongos, levaduras, plantas y animales.
Abstract
Aquí se describe el análisis de fluorescencia innata de una sola célula (CRIF) asistido por microscopía confocal, un método mínimamente invasivo para reconstruir la firma de fluorescencia celular innata de cada célula viva individual en una población distribuida en un espacio tridimensional (3D). La firma de fluorescencia innata de una célula es una colección de señales de fluorescencia emitidas por varias biomoléculas dentro de la célula. Estudios previos establecieron que las firmas de fluorescencia innata reflejan diversas propiedades celulares y diferencias en el estado fisiológico y son una rica fuente de información para la caracterización e identificación celular. Las firmas de fluorescencia innata se han analizado tradicionalmente a nivel poblacional, lo que requiere un cultivo clonal, pero no a nivel unicelular. CRIF es particularmente adecuado para estudios que requieren resolución 3D y / o extracción selectiva de señales de fluorescencia de células individuales. Debido a que la firma de fluorescencia es una propiedad innata de una célula, CRIF también es adecuado para la predicción sin etiquetas del tipo y / o estado fisiológico de células intactas y individuales. Este método puede ser una herramienta poderosa para el análisis celular simplificado, donde el fenotipo de cada célula individual en una población heterogénea puede evaluarse directamente por su firma de autofluorescencia bajo un microscopio sin etiquetado celular.
Introduction
Diversas biomoléculas dentro de una célula1 emiten señales de autofluorescencia, y la firma de fluorescencia innata de una célula consiste en el ensamblaje de estas señales. Esta fluorescencia característica refleja varias propiedades celulares y también diferencias en el estado fisiológico. El análisis de la fluorescencia innata es mínimamente invasivo y puede complementar las sondas microbiológicas tradicionales y más invasivas que dejan una gama de rastros desde una modificación metabólica leve hasta la destrucción celular completa. Si bien las técnicas tradicionales como la extracción de ADN o contenido celular2,3, la hibridación fluorescente in situ4 y la introducción de genes reporteros fluorescentes en el genoma son efectivas para determinar el tipo de célula o el estado fisiológico, comúnmente requieren la manipulación de las células o el etiquetado invasivo.
Los estudios de la fluorescencia innata de varias colonias microbianas vivas e intactas, incluyendo suspensiones de cultivo microbiano a granel5,6, lodos activos7, tejidos de mamíferos8,9 y células de mamíferos1,10, han demostrado que el análisis de fluorescencia innata facilita el análisis sin etiquetas de los tipos de células y el estado fisiológico. Las firmas de fluorescencia innata se han analizado tradicionalmente a nivel poblacional y no a nivel unicelular, por lo que requieren un cultivo clonal. Por el contrario, la técnica de análisis de fluorescencia innata unicelular asistida por microscopía confocal (CRIF)11 descrita aquí reconstruye y cataloga la firma de fluorescencia celular innata de cada célula microbiana viva individual. Además, CRIF puede recopilar sistemáticamente la firma de fluorescencia innata de una sola célula microbiana dentro de una población que se distribuye en un espacio tridimensional (3D).
Protocol
Representative Results
Discussion
Hay dos puntos críticos en este método que deben seguirse de cerca para obtener resultados reproducibles: 1) mantener la salida de potencia del láser bajo el objetivo del microscopio consistente a través de longitudes de onda de excitación y experimentos, y 2) realizar una segmentación celular precisa.
El primer punto es particularmente importante cuando se compara la firma de fluorescencia innata entre diferentes experimentos. Evite simplemente aplicar la misma configuración de “porcen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado en parte por una subvención para la investigación científica del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes y Tecnología de Japón (18K04843) a Y. Yawata, el JST ERATO (JPMJER1502) a N. Nomura.
Materials
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
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