Tek Hücreli Doğuştan Gelen Floresan İmzalarının Konfokal Mikroskopi ile Yeniden Yapılandırılması
Summary
Burada, üç boyutlu bir alanda dağıtılan her canlı hücreden doğuştan gelen hücresel floresan imzalarının (yani hücresel otofluoresans) optik olarak çıkarılması ve kataloglanması için bir protokol sunulmaktadır. Bu yöntem, bakteri, mantar, maya, bitki ve hayvanlardan gelen hücreler de dahil olmak üzere çeşitli biyolojik sistemlerin doğuştan gelen floresan imzasını tek hücreli çözünürlükte incelemek için uygundur.
Abstract
Burada açıklanan konfokal yansıma mikroskopi destekli tek hücreli doğuştan gelen floresan analizi (CRIF), üç boyutlu (3D) bir alanda dağılmış bir popülasyondaki her bir canlı hücreden doğuştan gelen hücresel floresan imzasını yeniden oluşturmak için minimal invaziv bir yöntemdir. Bir hücrenin doğuştan gelen floresan imzası, hücre içindeki çeşitli biyomoleküllerin yaydığı floresan sinyallerinin bir koleksiyonudur. Önceki çalışmalar, doğuştan gelen floresan imzaların fizyolojik durumdaki çeşitli hücresel özellikleri ve farklılıkları yansıttığını ve hücre karakterizasyonu ve tanımlanması için zengin bir bilgi kaynağı olduğunu ortaya konmuştur. Doğuştan gelen floresan imzalar geleneksel olarak nüfus düzeyinde analiz edilmiş, klonal bir kültür gerektirmiştir, ancak tek hücre düzeyinde değildir. CRIF özellikle 3D çözünürlük ve/veya bireysel hücrelerden floresan sinyallerinin seçici olarak çıkarılmasını gerektiren çalışmalar için uygundur. Floresan imzası bir hücrenin doğuştan gelen bir özelliği olduğundan, CRIF, sağlam ve tek hücrelerin türünün ve/veya fizyolojik durumunun etiketsiz tahmini için de uygundur. Bu yöntem, heterojen popülasyondaki her bir hücrenin fenotipinin hücre etiketlemesi olmadan bir mikroskop altında otofluoresans imzası ile doğrudan değerlendirilebileceği aerodinamik hücre analizi için güçlü bir araç olabilir.
Introduction
Bir hücre içinde çeşitli biyomoleküller1 otofluoresans sinyalleri yayar ve bir hücrenin doğuştan gelen floresan imzası bu sinyallerin montajından oluşur. Bu imza floresan çeşitli hücresel özellikleri ve fizyolojik durum farklılıklarını yansıtır. Doğuştan gelen floresan analizi minimal invazivdir ve hafif metabolik modifikasyondan hücre yıkımına kadar bir dizi iz bırakan geleneksel, daha invaziv mikrobiyolojik probları tamamlayabilir. DNA veya hücre içeriği ekstraksiyonu2,3, floresan in situ hibridizasyon4 ve floresan muhabir genlerinin genoma girmesi gibi geleneksel teknikler hücre tipinin veya fizyolojik durumun belirlenmesinde etkili olsa da, genellikle hücrelerin manipülasyonunu veya invaziv etiketlemeyi gerektirir.
Toplu mikrobiyal kültür süspansiyonları5,6, aktif çamurlar7, memeli dokuları8,9 ve memeli hücreleri1,10 dahil olmak üzere çeşitli canlı ve bozulmamış mikrobiyal kolonilerin doğuştan gelen floresan çalışmaları, doğuştan gelen floresan analizinin hücre tiplerinin ve fizyolojik durumun etiketsiz analizini kolaylaştırdığını göstermiştir. Doğuştan gelen floresan imzalar geleneksel olarak tek hücre düzeyinde değil, nüfus düzeyinde analiz edilmiştir ve bu nedenle klonal bir kültür gerektirmektedir. Buna karşılık, burada açıklanan confokal reflection mikroskopi destekli tek hücreli innate fluoresans analizi (CRIF) tekniği11, her bir canlı mikrobiyal hücrenin doğuştan gelen hücresel floresan imzasını yeniden yapılandırır ve kataloglar. Ayrıca CRIF, üç boyutlu (3B) bir alanda dağıtılan bir popülasyondaki tek bir mikrobiyal hücrenin doğuştan gelen floresan imzasını sistematik olarak harmanlayabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntemde tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için yakından takip edilmesi gereken iki kritik nokta vardır: 1) mikroskop altındaki lazer güç çıkışını uyarım dalga boyları ve deneyleri ile tutarlı tutmak ve 2) doğru hücre segmentasyonu gerçekleştirmek.
İlk nokta, farklı deneyler arasında doğuştan gelen floresan imzasını karşılaştırırken özellikle önemlidir. Maksimum güç çıkışı lazer hatları arasında büyüklük sırasına kadar farklılık göstereb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma kısmen Japonya Eğitim, Kültür, Spor ve Teknoloji Bakanlığı’ndan (18K04843) Y. Yawata’ya, JST ERATO’dan (JPMJER1502) N. Nomura’ya bilimsel araştırmalar için bir hibe ile desteklendi.
Materials
| Agarose | Wako Chemicals | 312-01193 | |
| Beam splitters | Carl Zeiss, Nikon | MBSInVis405, MBS458, MBS488, MBS458/514, MBS488/543, or MBS 488/543/633 beam splitters (Carl Zeiss) | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss, Nikon | Model LSM 880 (Carl Zeiss), Model A1R (Nikon) | |
| Cover slips | Matsunami Glass | C024601 | |
| Glass slides | Matsunami Glass | S011120 | |
| Half-reflection mirror | Carl Zeiss, Nikon | NT80/20 | |
| Laser power meter | Thorlabs | PM400 (power meter console) and S175C (sensor) | |
| LB Broth | Nacalai tesque | 20066-95 | For bacteria culture |
| Image analysis software | The MathWorks | MATLAB version 2019a or later, Image Processing Toolbox is needed | |
| Microscope objective | Carl Zeiss, Nikon | 440762-9904 | e.g. 63x plan Apochomat NA = 1.4 (Carl Zeiss) |
| Microscope software | Carl Zeiss, Nikon | ZEN (Carl Zeiss),NIS-elements (Nikon) | |
| PBS(-) | Wako Chemicals | 166-23555 | |
| Programming language | Python and libraries, modules (numpy, scikit-learn, scikit-image, os, glob, matplotlib, tkinter) are rquired to run the supplied PCA script. | ||
| Silicone gasket | ThermoFisher Scientific | P24744 | |
| Workstation | A high-performance workstation with discrete GPUs is recommended. | ||
| Yeast extract-peptone-dextrose (YPD) agar medium | Sigma-Aldrich | Y1500-250G | For yeast culture |
| YPD medium | Sigma-Aldrich | Y1375-250G |
References
- Monici, M. Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications. Biotechnology Annual Review. 11, 227-256 (2005).
- Tang, J. Microbial metabolomics. Current Genomics. 12, 391-403 (2011).
- Woo, P. C., Lau, S. K., Teng, J. L., Tse, H., Yuen, K. Y. Then and now: use of 16S rDNA gene sequencing for bacterial identification and discovery of novel bacteria in clinical microbiology laboratories. Clinical Microbiology and Infection. 14, 908-934 (2008).
- Amman, R., Fuchs, B. M. Single-cell identification in microbial communities by improved fluorescence in situ hybridization techniques. Nature Reviews Microbiology. 6, 339-348 (2008).
- Giana, H. E., Silveira, L., Zângaro, R. A., Pacheco, M. T. T. Rapid identification of bacterial species by fluorescence spectroscopy and classification through principal components analysis. Journal of Fluorescence. 13 (6), 489-493 (2003).
- Leblanc, L., Dufour, E. Monitoring the identity of bacteria using their intrinsic fluorescence. FEMS Microbiology Letters. 211 (2), 147-153 (2002).
- Hou, X., Liu, S., Feng, Y. The autofluorescence characteristics of bacterial intracellular and extracellular substances during the operation of anammox reactor. Scientific Reports. 7, 39289 (2017).
- Ramanujam, N., et al. In vivo diagnosis of cervical intraepithelial neoplasia using 337-nm-excited laser-induced fluorescence. Proceeding National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (21), 10193-10197 (1994).
- Zhang, J. C., et al. Innate cellular fluorescence reflects alterations in cellular proliferation. Lasers in Surgery and Medicine. 20 (3), 319-331 (1997).
- Gosnell, M. E., et al. Quantitative non-invasive cell characterisation and discrimination based on multispectral autofluorescence features. Scientific Reports. 6, 23453 (2016).
- Yawata, Y., et al. Intra- and interspecies variability of single-cell innate fluorescence signature of microbial cell. Applied and Environmental Microbiology. 85, 00608-00619 (2019).
- Nelson, K. E., et al. Complete genome sequence and comparative analysis of the metabolically versatile Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 4 (12), 799-808 (2002).
- Bagdasarian, M., et al. Specific-purpose plasmid cloning vectors. II. Broad host range, high copy number, RSF1010-derived vectors, and a host-vector system for gene cloning in Pseudomonas. Gene. 16 (1-3), 237-247 (1981).
- Luo, Y., Vijaychander, S., Stile, J., Zhu, L. Cloning and analysis of DNA-binding proteins by yeast one-hybrid and one-two-hybrid systems. Biotechniques. 20 (4), 564-568 (1996).
- Yawata, Y., et al. Monitoring biofilm development in a microfluidic device using modified confocal reflection microscopy. Journal of Bioscience and Bioengineering. 110 (3), 377-380 (2010).
- Lakowicz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third edition. , (2006).
- Blacker, T. S., Duchen, M. R. Investigating mitochondrial redox state using NADH and NADPH autofluorescence. Free Radical Biology & Medicine. 100, 53-65 (2016).
- Croce, A. C., Bottiroli, G. Autofluorescence spectroscopy and imaging: A tool for biomedical research and diagnosis. European Journal of Histochemistry. 58 (4), 2461 (2014).
