Kvantitativ RT-PCR med hög genomströmning i en- och bulk C. elegansprover med nanofluidisk teknik

Summary

I den här artikeln beskrivs ett protokoll med hög genomströmning för snabb och tillförlitlig bestämning av genuttrycksnivåer i enstaka eller bulk C. elegans prover. Detta protokoll kräver inte RNA-isolering och producerar cDNA direkt från prover. Det kan användas tillsammans med höggenomströmning multiplexerade nanofluidiska qPCR-plattformar i realtid.

Abstract

Detta dokument presenterar en hög genomströmning omvänd transkription kvantitativ PCR (RT-qPCR) analys för Caenorhabditis elegans som är snabb, robust och mycket känslig. Detta protokoll erhåller exakta mätningar av genuttryck från enstaka maskar eller från bulkprover. Protokollet som presenteras här ger en ny anpassning av befintliga metoder för kompletterande DNA (cDNA) förberedelse i kombination med en nanofluidic RT-qPCR plattform. Den första delen av detta protokoll, med namnet "Worm-to-CT", tillåter cDNA-produktion direkt från nematoder utan behov av tidigare mRNA-isolering. Det ökar experimentell genomströmning genom att tillåta beredning av cDNA från 96 maskar i 3,5 h. Den andra delen av protokollet använder befintlig nanofluidisk teknik för att köra RT-qPCR med hög genomströmning på cDNA. Detta dokument utvärderar två olika nanofluidiska chips: de första kör 96 prover och 96 mål, vilket resulterar i 9 216 reaktioner på cirka 1,5 dagars bänkarbete. Den andra chiptypen består av sex 12 x 12 matriser, vilket resulterar i 864 reaktioner. Här demonstreras Worm-to-CT-metoden genom att kvantifiera mRNA-nivåer av gener som kodar värmechockproteiner från enstaka maskar och från bulkprover. Provided är en omfattande lista över primers utformade för att förstärka bearbetat RNA för majoriteten av kodningsgener inom C. elegans genomet.

Introduction

Optimeringen av encellig RNA-sekvensering och qPCR visade att transkriptionspulser eller bursts kan leda till massiv variation i antalet RNA-molekyler per cell¹. Vidare upptäckte dessa tekniker betydande cellulära heterogenitet som tidigare missats av standard bulk transkriptomiska mätningar. Beroende på sammanhanget orsakas vissa encelliga transkriptionsvariationer av blandad cellulär sammansättning av vävnader. Men även i isogena cellpopulationer som odlas under samma miljö finns det utbredd transkriptionell^{heterogenitet 2,3}. Denna "biologiska variabilitet" identifieras alltmer som en allestädes närvarande egenskap hos cellulära nätverk, från bakterier till människor. I vissa fall kan det ha fenotypiska konsekvenser i utveckling, cancerprogression, HIV-latens och svar på kemoterapi^4,5.

Nematoden Caenorhabditis elegans är en unik modellorganism med idealiska egenskaper för att studera orsakerna till och konsekvenserna av biologisk variabilitet mellan individer. Dessa nematoder är en enkel modellorganism bestående av 959 celler, och deras genomskinliga nagelband gör dem mottagliga för in vivo-avbildningsstudier⁶. C. elegans är en hermafroditisk art som huvudsakligen reproducerar sig genom självbefruktning; detta resulterade i isogena laboratoriestammar. Trots isogenicitet och kontrollerade odlingsförhållanden är många fenotyper och transkriptioner varierande mellan individer, vilket tyder på att stokastiska eller mikromiljömässiga skillnader bidrar till heterogenitet mellan individer^7,8. Sådan variabilitet i genuttryck har flera fitnesskonsekvenser, inklusive variabilitet i penetransen av mutationer, överlevnad, utvecklings timing och fecundity^7,8,9. På grund av dessa funktioner ger enmaskstudier den oöverträffade möjligheten att studera biologisk variabilitet i en hel organism.

Det finns ett grundläggande behov inom området att utveckla och optimera teknik för korrekt detektering av transkriptioner på en enda masknivå. Ny teknik, såsom enmaskig RNA-sekvensering^10,RNA-sekvensering från isolerade^{vävnader 11}, och encellig^{sekvensering 12} finns nu tillgängliga för C. elegans. En huvudutmaning kvarstår dock: vid övervakning av interindividualitet faller svagt uttryckta gener ofta under detekterbara nivåer¹³. Detta är särskilt relevant för sällsynta transkriptioner som isolerats från små mängder utgångsmaterial, eftersom det finns ett väletablerat, omvänt samband mellan genomsnittligt uttryck och teknisk varians, vilket ofta orsakar sällsynta transkriptioner att falla under statistiska brytningar¹³. Optimeringen av multiplexed qPCR-teknik med hög genomströmning har visat sig vara användbar för encelliga studier på däggdjur, särskilt när man studerar uttrycket av sällsynta^{transkriptioner 14,15}. Denna teknik kan också användas för benchmarking och validering av andra enmaskiga tekniker.

Worm-to-CT är en snabb, robust metod anpassad från ett kit som används i cellbiologistudier, för cDNA-beredning med en mask. cDNA erhölls med denna metod tillsammans med multiplexerad nanofluidisk qPCR-teknik valdes eftersom den ger högre experimentell genomströmning, ett bredare dynamiskt detektionsområde och har validerats för encelliga^{ändamål 14,15}. CDNA-preparatet som beskrivs är också tillämpligt för användning med standard PCR-teknik. Genomströmningen ökas på två sätt: För det första är cDNA-preparatet snabbare och mer tillförlitligt än traditionell guanidium tiocyanat-fenol-kloroform extraktion, eftersom maskar läggs direkt till lysisbufferten och hoppar över direkt isolering av lätt nedbrytbart RNA. För det andra ökar användningen av nanofluidisk teknik avsevärt antalet prover och mål som kan köras samtidigt. I det här dokumentet jämförs två chips: ett chip med en matris och ett chip med flera matriser. Ett chips med en matris kan köra 96 enkla maskar och 96 primeruppsättningar, vilket resulterar i 9 216 reaktioner per experiment. För att utföra ett liknande data flöde med hjälp av standard qPCR-tekniker skulle det krävas 96 separata qPCR-experiment med hjälp av 96 brunnsplattor. Det mindre och mer flexibla multimatrischipet består av sex 12 x 12 matriser vilket resulterar i 864 reaktioner. Metodens överlägsna tillförlitlighet och känslighet ökas av nanofluidisk teknik och genom införandet av ett förförökningssteg. Metoden som presenteras i detta dokument är avsedd att användas tillsammans med en toppmodern statistisk algoritm för att extrahera biologisk varians. Den här artikeln presenterar protokollet för snabb cDNA-förberedelse och qPCR med hög genomströmning för både enmask- och batchmaskprover. algoritmen kommer att publiceras någon annanstans. För det här protokollet bör organisationen för varje chip förberedas före experimentet. Tabell 1 och tabell 2 visar exempel på dessa planer för ett chip med flera matriser respektive en matris. Det finns också översikter över Worm-to-CT-protokollet som beskrivs i figur 1 och som kör chipsen med flera matriser och en matris i figur 2.

Protocol

OBS: Genom hela detta protokoll kallas Caenorhabditis elegans för "mask" eller "maskar". En mängd olika C. elegans-stammar kan beställas via onlinedatabaser eller genom att direkt kontakta laboratorier som använder modellorganismen. Del I i detta protokoll (avsnitt 1−3) beskriver cDNA-förberedelse genom Worm-to-CT-protokollet. Del II i detta protokoll (avsnitt 4−13) beskriver körning av RT-qPCR med hög genomströmning med nanofluidik, anpassad från ett protokoll utvecklat av Fluidigm¹⁶. Detta protokoll gäller användningen av de två typer av nanofluidiska chips som definierats tidigare, chipet med en matris, som kan övervaka 96 mål i 96 prover (totalt 9 216 RT-qPCR-reaktioner) eller chipet med flera matriser, som fungerar som underenheter till 12 mål x 12 prover. Varje chip med flera matriser innehåller sex oberoende matriser som kan köras tillsammans eller separat. Om du till exempel använder ett helt chip med flera matriser kan du övervaka 72 mål x 12 prover (eller vice versa) eller 36 mål x 24 prover (eller vice versa). Mer information om något av de material som används i detta protokoll finns i materialförteckningen.

1. VALIDERING AV RT-qPCR primer

OBS: Primers i realtid designades baserat på de rekommenderade egenskaperna som ursprungligen utfärdades av MIQUE-riktlinjerna¹⁷. För att göra primers specifika för bearbetat RNA utformades produkter så att de två primersna bundna till vardera sidan av minst en skarvkorsning. Kraven på lämpliga primers inkluderade 20%−80% guanin- och cytosinhalt, en smälttemperatur på 58−60 °C, en skillnad i smälttemperatur mellan primerpar på ≤0,5 °C och en produktlängd på 70–120 bp. Sekvensen av de primers som genereras finns i kompletterande tabell 1. Öppen källkod för de skript som används för att generera primers finns på https://github.com/s-andrews/wormrtpcr. Primer par för transkriptioner med skarv webbplatser utformades så att de ligger i två exons flankerar en intron men var inte utformade för att vara skarv-variant specifika, med NCBI Primer Blast programvara¹⁸. För denna studie sprängdes primeruppsättningarna mot C. elegans genomet för att testa för någon off-target komplementaritet.

1. Hämta primers från databasen med RT-qPCR primers(kompletterande tabell 1). Alternativt kan du designa qPCR primer-par med onlineverktyg som NCBI Primer Blast¹⁸.
2. Utför en qPCR-standardkurva för att övervaka specificitet och PCR-effektivitet för varje par primers med standard qPCR-tekniker¹⁹ och enligt MIQUE-riktlinjerna^17,20.
   OBS: Endast primerpar med R² > 0,98 och PCR-effektivitet mellan 85% och 115% bör användas. Sekvensen, PCR-effektiviteten och R² för de primers som används i denna studie beskrivs i tabell 3.

2. Masklysning genom Mask-till-CT

1. Plocka maskarna från deras bakteriella gräsmatta på en färsk, osedd NGM-platta och låt maskarna röra sig runt plattan i 5 minuter för att ta bort de flesta bakterierna från masken genom sin rörelse.
   OBS: Bakteriegräsmattan och odlingsförhållandena kommer att variera beroende på den experimentella designen. De experiment som presenteras här kräver 6 cm NGM-plattor sådda med OP50 Escherichia coli med maskar av intresse som odlas till steg L4.9 i en 20 °C inkubator.
2. I en RNase-fri huva, förbered en master mix bestående av 12,5 μL 2x RT-buffert, 1,25 μL 20x RT enzymbuffert och 0,25 μL nukleasfritt vatten per prov. Tillsätt 14 μL huvudblandning till 11 μL av varje prov från steg 2.8.
3. Placera locket på en PCR-remsa upp och ner på plattformen för dissekeringsomfånget och tillsätt 10 μL lysisblandningen till kupolformade PCR-rörlock under ett sammansatt mikroskop.
   OBS: Med endast ett eller två prover är det bättre att använda en PCR-remsa som innehåller minst fyra rör, eftersom detta minskar risken för att locken blästrar upp i de efterföljande frys-tinande stegen. Alternativt kan gummiband användas för att hålla locken på plats. Se i så fall till att locken är ordentligt stängda varje gång rören överförs.
4. Plocka maskarna från plattan i varje kortplats på locket som innehåller lysisblandningen genom att "skopa" dem (dvs. fånga maskarna under med plockningen) för att undvika bakteriell förorening. Stäng rören och snurra ner dem i 5 s med hjälp av en bordsmikrocentrifug(Materialförteckning)innan du placerar dem i en Dewar-kolv fylld med flytande kväve.
   OBS: Mellan 15 och 30 maskar bör användas för bulkexperiment och 1 mask för enmaskmätningar.
   VARNING: Vid hantering av flytande kväve använd Cryo-Gloves samt skyddande glasögon och följ standardkläder, eftersom kontakt med huden eller ögonen kan orsaka allvarliga köldskador.
5. Frys upp PCR-rören 10x genom att överföra dem mellan flytande kväve och ett ~40 °C vattenbad. Lämna rören i det flytande kvävet i minst 5 s för att säkerställa att proverna är helt frysta. Lämna rören i vattenbadet tills proverna tinar. Lämna inte in under en längre period, eftersom detta leder till RNA-nedbrytning.
   OBS: Rör kan lämnas i flytande kväve under en längre tid, eftersom proverna fryses till cirka -200 °C, vilket minskar RNA-nedbrytningen. Detta bör dock inte vara en protokollstopppunkt, eftersom flytande kväve avdunstar snabbt.
6. Blanda proverna på en termisk blandare(Table of Materials)inställd på 4 °C i 20−30 min roterande vid ~1 800 varv/min.
7. Medan proverna blandas, tina stopplösningen på is.
8. Snurra ner proverna med hjälp av en bordsmikrocentrifug (Materialförteckning) och tillsätt 1 μL stopplösning till varje rör.
   OBS: Proverna kan lämnas vid -80 °C i upp till 1 vecka innan de omvända transkribering av RNA (avsnitt 3).

3. Omvänd transkription

OBS: För omvänd transkription av enstaka maskar genererades resultaten som visas här med hjälp av reagenserna som medföljer nanofluidchipsen (alternativ 2 i figur 1). De reagenser som markerats i alternativ 2 i figur 1 användes också för omvänd transkription av poolade prover. Båda metoderna fungerar omväxlande för de olika provtyperna.

1. Omvänd transkription av enstaka maskar
   1. I en RNase-fri huva, tillsätt 1,25 μL omvänd transkriptionsblandning(Table of Materials)till ett nytt PCR-rör.
      OBS: En 96 brunn PCR-platta och en automatisk pipett kan användas om det finns många prover. Tillverkarens protokoll säger att 1 μL kan användas per prov.
   2. Ta 5 μL lyslösning och stoppa lösningsblandningen från steg 2.8 och tillsätt den i det färska PCR-röret som innehåller den omvända transkriptionsblandningen.
      OBS: Tillverkarens protokoll säger att 1 μL RNA (2,5 pg/μL–250 ng/μL) kan användas per reaktion. En negativ RT-kontroll per platta kan tillsättas genom att ersätta den omvända transkriptionsblandningen med 5 μL lysat prov och 1,25 μL RNAse-fritt vatten.
   3. Kör proverna med hjälp av följande omvända transkriptionsprogram på en termocyklist: 25 °C i 5 min, 42 °C i 30 min, 85 °C i 5 min och 4 °C ∞.
      OBS: Den cDNA som produceras kan lagras vid -20 °C innan den fortsätter till förstärkning och datainsamling med hjälp av qPCR med hög genomströmning.
2. Omvänd transkription för massprover (15−30 maskar)
   1. I en RNase-fri huva, förbered en master mix bestående av 12,5 μL 2x RT-buffert, 1,25 μL 20x RT enzymbuffert och 0,25 μL nukleasfritt vatten per prov. Tillsätt 14 μL mastermix till 11 μL lyslösning och stoppa lösningsblandningen från steg 2.8.
      OBS: Vid hantering av ett stort antal prover kan detta utföras i 96 brunnsplattor.
   2. Kör proverna genom en termocyklist med följande omvända transkriptionsprogram: 37 °C i 60 min, 95 °C i 5 min och 4 °C ∞.
   3. Späd ut den producerade cDNA 1:4 i nukleasfritt vatten.
      OBS: I allmänhet kommer produkterna till en slutlig volym på 25 μL, i vilket fall 75 μL ska tillsättas. På grund av kondens kan dock den slutliga volymen variera. Justera därför därefter för att göra ett 1:4-förhållande i den slutliga lösningen. Detta utspädningssteg gäller inte om qPCR utförs på enkla maskar. Den cDNA som produceras kan lagras vid -20 °C innan den fortsätter till förstärkning och datainsamling med hjälp av qPCR med hög genomströmning.

4. Förbereda multiplexprimerblandningen

1. Förbered ett framåt/bakåtriktat (F/R) primerlager för varje par primers vid 50 μM slutlig koncentration. Blanda samma volym framåt och omvända primers vid 100 μM vardera.
2. Kombinera 1 μL 50 μM F/R primerlager för varje primerpar som ska testas. Tillsätt DNA-suspensionsbufferten upp till en total volym på 100 μL.
   OBS: Stockprimerkoncentrationerna här skiljer sig från de som beskrivs i tillverkarens protokoll¹⁶ men behåller samma slutliga koncentration på 500 nM.

5. Målspecifik förförstärkning

1. Förbered en huvudblandning som innehåller 1 μL mastermix före amplification (Materialförteckning),0,5 μL av den poolade primerblandningen (steg 4.2) och 2,25 μL nukleasfritt vatten per reaktion med en total överskottsvolym på 10 % .
2. I en 96 brunnsplatta blandas alikvot 3,75 μL av masterblandningen i så många brunnar som krävs för att antalet prover ska köras.
3. Tillsätt 1,25 μL av de cDNA-lösningar av intresse som genereras i steg 3.1.3 eller 3.2.3 till varje brunn.
4. Täck plattan med 96 brunnstätningsband, kort virvel och centrifugera med en bordsplatta. Överför till en termocyklist och kör följande program: 95 °C i 2 min, 15 denatureringscykler vid 95 °C för 15 s, glödgning/förlängning vid 60 °C i 4 min och 4 °C för ∞.
   OBS: Tillverkaren rekommenderar från 10−20 cykler för preamplification reaktion¹⁶. Detta protokoll rekommenderar 10 eller 15 cykler beroende på målgenens uttrycksnivåer.

6. Exonuklease I behandling

OBS: Detta är att ta bort oinkorporerade primers från preamplification.

1. Bered en exonukleas I-blandning som innehåller 0,2 μL exonukleas I-reaktionsbuffert (Materialförteckning),0,4 μL exonukleas I vid 20 U/μL (Materialförteckning) och 1,4 μL nukleasfritt vatten per prov. Håll alla reagenser på is, speciellt exonukleasen I.
2. Ta bort 96 brunnsplattan (steg 5.4) från termocyklisten, centrifug med bordsplattans snurra och ta försiktigt bort tätningen. Tillsätt 2 μL av exonukleasen jag blandar till varje preamplification reaktion. Återförslutning, centrifug och placera 96 brunnsplattan tillbaka i termocyklisten med hjälp av följande program: 37 °C i 30 min, 80 °C i 15 min och 4 °C i ∞.
3. Ta ut proverna ur termocyklisten och späd ut dem 1:5 genom att tillsätta 18 μL 1x Tris EDTA-buffert (Materialförteckning).
   OBS: Det är möjligt att hålla cDNA-proverna vid -20 °C för senare användning. Tillverkarens protokoll föreslår potentiella utspädningar på 5x, 10x eller 20x i detta^{skede 16}, beroende på uttrycksnivån för mål av intresse.

7. Förbereda analysblandningarna

OBS: Analysblandningar kan beredas i 384 brunnsplattor, eftersom brunnarna har samma avstånd som nanofluidchipsen, vilket underlättar belastningen.

1. Förbereda analysblandningar för ett chip med flera matriser
   1. Förbered en huvudblandning bestående av 2 μL 2x analysbelastningsreagens(Materialförteckning)och 1,6 μL DNA-suspensionsbuffert (Materialförteckning) för varje brunn enligt den utarbetade planen. Aliquot 3.6 μL av denna master mix per brunn i en 384 brunnsplatta.
   2. Tillsätt 0,4 μL av det 50 μM F/R primerlager som bereds i steg 4.1 till lämpliga brunnar enligt den förberedda planen.
      OBS: Detta ger totalt 4 μL analysblandning per brunn, med ett överskott på 1 μL.
2. Förbereda analysblandningar för ett chip med en matris
   1. Förbered en huvudblandning bestående av 3 μL 2x testlastningsreagens och 2,4 μL DNA-suspensionsbuffert för varje brunn enligt den utarbetade planen. Aliquot 5,4 μL av denna master mix per brunn i en märkt 384 brunnsplatta.
   2. Tillsätt 0,6 μL av 50 μM F/R primer-beståndet till lämpliga brunnar enligt den förberedda planen.
      OBS: Detta ger totalt 6 μL analysblandning per brunn, med ett överskott på 1 μL.

8. Förbereda provblandningarna

OBS: Provblandningar kan beredas upp till 1 dag i förväg och förvaras vid 4 °C.

1. Förbereda prover för ett chip med flera matriser
   1. Bered en huvudblandning av provet bestående av 2 μL 2x fluorescerande sondsmugg med låg ROX (Table of Materials) och 0,2 μL provreagens (Materialförteckning) per prov. Dispensera 2,2 μL av denna blandning i den märkta 384 brunnsplattan.
      OBS: Tillverkaren rekommenderar att provreagenset^{16 inte virvlas bort.}
   2. Pipett 1,8 μL av varje förförstärkad, exonukleas behandlade jag prov från steg 3.2.3 till lämpliga brunnar enligt den utarbetade planen.
      OBS: Detta ger totalt 4 μL, med ett överskott på 1 μL.
2. Förbereda prover för ett chip med en matris
   1. Bered en provhuvudblandning bestående av 3 μL 2x fluorescerande sondsmugg med låg ROX(Materialförteckning)och 0,3 μL 20x DNA-bindande färgprovsbelastningsreagens(Materialförteckning)per prov. Dispensera 3,3 μL av denna blandning i den märkta 384 brunnsplattan.
   2. Pipett 2,7 μL av varje förförstärkad och exonukleas behandlade jag prov från steg 6.3 till lämpliga brunnar enligt den utarbetade planen.
      OBS: Detta ger totalt 6 μL, med ett överskott på 1 μL. Om det finns några brunnar som ska köras utan prov skall dessa lastas med provblandning och 2,7 μL vatten i stället för cDNA. Detta rekommenderas för båda chiptyperna. Maskinen behöver låg ROX i varje inlopp för att upptäcka chipets nät.

9. Priming nanofluidic chip

Obs: Ett chip med flera matriser behöver bara primes vid första körningen. Om det finns efterföljande körningar av samma chip kan detta steg hoppas över. Dessa steg är desamma för båda chiptyperna.

1. Injicera långsamt och försiktigt hela 150 μL av kontrollledningsvätskan från sprutorna som ingår i chipens ackumulatorer. Se till att ingen kontrollvätska vidrör chippet genom att hålla chipet i 45° vinkel och hålla bort sprutans spets för att undvika spill.
2. Ta bort den blå skyddsfilmen från botten av chippet.
3. Placera chippet i nanofluidik pcr-primingmaskinen (Table of Materials), med streckkoden vänd utåt. Kör manuset "Prime (153x),som tar ~15–20 min.
   OBS: Slå på nanofluidiktermocyclern(Table of Materials)i detta skede, eftersom kameran tar ca 10 minuter att svalna till under 0 °C.

10. Lastning av nanofluidiskt chip

1. Ta bort barriärpluggarna sekventiellt när lastning sker. Detta minskar risken för fellastning av brunnar.
2. Överför antingen 3 μL för ett chip med flera matriser eller 5 μL för ett chips med en matris av varje primeranalysblandningar och provblandningar till motsvarande inlopp av det nanofluidiska chipet enligt den utarbetade planen. Se till att inte införa bubblor, vilket kan leda till att den totala överförda volymen blir mindre än önskat.
   OBS: Om det finns några brunnar som kommer att köras utan primer är det viktigt att dessa laddas med master mix och ersätter primervolymen med vatten. Detta gäller båda chiptyperna. I detta skede kan det vara lättare att placera chipet på en mörk yta, vilket gör att brunnarna lättare kan ses.

11. Kör det nanofluidiska chipet

Obs: Första gången du kör ett chip med flera matriser ställer du in spårningsfilen genom att välja Verktyg | Flex Six Usage Tracking, klicka på Ny, ange ett filnamn och välj en plats innan du klickar på Klar.

1. Öppna datainsamlingsprogrammet. Klicka på Starta ny körning. Placera det laddade chipet i nanofluidics termocyklisten med streckkoden vänd utåt.
2. Välj projektinställning om tillämpligt och klicka sedan på Nästa | Ladda. Om du läser in ett chip med flera matriser väljer du de partitioner (matriser) som ska köras.
3. Välj programmets referens avsökningaroch ändra sedan programtypen till Genuttryckoch ändra den passiva referensen till ROX. Välj analys av enstaka avsökningar, ändra avsökningstypen till Eva Greenoch klicka på Nästa.
4. Välj det termiska cykelprotokollet GE FLEX sex Fast PCR+Melt v1 för att köra ett chip med flera matriser, eller protokollet GE 96.96 Fast PCR+Melt v2 för att köra ett chip med en matris.
5. Bekräfta att Automatisk exponering är markerat och klicka på Starta körning.

12. Efter chipkörning

OBS: Det här avsnittet är endast nödvändigt för chips med flera matriser när du inte använder hela chippet.

1. Ta ut chippet ur nanofluidics termocyklisten och ladda in i nanofluidics PCR priming maskin och kör Post Run (153x) skript, som varar 5 min.
2. Märk de kontakter som används för personlig referens.
   OBS: Chippet kan nu förvaras i rumstemperatur och de återstående matriserna på chipet kan köras inom 2 månader.

13. Datarensning och dataanalys

1. Öppna data i programvaran" Pcr Analysis " irealtid (Materialförteckning ). Kontrollera smälttoppen för varje primerpar som testas. Eliminera resultat som uppvisar mer än en smälttemperaturtopp, för ett givet primerpar.
   OBS: Flera toppar visas bara ibland, förmodligen när primerpar bildar dimers, eller från interaktioner av målprimrar med andra primers i den poolade primerblandningen.
2. Exportera data som en "heatmap"-kalkylbladsfil och eliminera misslyckade exempel eller primers.
3. Analysera data med hjälp av standardmetoden Delta-Ct²¹. För statistisk utvärdering utför enkelvägs ANOVA på relativa uttrycksnivåer.

Representative Results

Validering av Worm-to-CT som cDNA-beredningsmetod

För att testa om Worm-to-CT-protokollet är en giltig cDNA-extraktionsmetod jämfördes det med vanliga guanidium tiocyanat-fenol-kloroform extraktionsmetoder. Resultaten visas i figur 3, där cDNA framställdes av i genomsnitt ~1 000 maskar med hjälp av standard guanidiumtiocyanat-fenol-kloroformextraktionstekniker²² och från 30 maskar med hjälp av Worm-to-CT-metoden. Proverna värmechockade samtidigt (30 min vid 34 °C). Globalt var hsp-70 mRNA uttryck nivåer per 100 ng av totala RNA jämförbara med båda metoderna. När det gäller högsta hsp-70-uttryck (dvs. i N2 efter värmechock) var uttrycksnivåerna dock högre med Worm-to-CT-metoden, vilket indikerar förbättrad känslighet.

För att avgöra om en förväntad minskning av hsp uttryck i hsf-1(sy441)²³, en mutation i den huvudsakliga transkriptionella regulatorn av molekylära förkläde^23,24, kunde reproduceras, transkriptionell förkläde induktion efter en kort värme chock jämfördes. Med båda metoderna upptäcktes en minskning av hsp-70 induktion i hsf-1(sy441) djur. Detta förväntades, eftersom mutanta hsf-1(sy441) djur uppvisar en minskad förmåga att inducera förkläden på grund av att en trunkering i transaktivering domänen HSF-1. För guanidium tiocyanat-fenol-kloroform extraktion hsp70 minskade med 82,7% jämfört med kontroller och 92,3% för Worm-to-CT jämfört med vilda djur (Figur 3). Resultaten var jämförbara mellan båda metoderna och jämförbara med tidigare rapporter²³. Dessa resultat indikerar att Worm-to-CT-metoden är ett giltigt alternativ till vanliga cDNA-syntestekniker.

Validering av pcr-plattformen för nanofluidik som används för att förstärka mRNA-mål

För att testa konsekvensen i resultaten med hjälp av nanofluidisk qPCR för transkriptionsförstärkning jämfördes PCR-resultaten från massmetoden Worm-to-CT både på ett standard qPCR-system(Table of Materials)och ett nanofluidiskt qPCR-system med hjälp av ett chip med flera matriser. Den vikbara förändringen i uttrycket av tre olika gener, sma-3 (Figur 4A), sma-10 (Figur 4B), och dnj-26, övervakades (Figur 4C) hos djur som bär en null allel i dbl-1 (dbl-1(nk3))²⁵ jämfört med vilda typ motsvarigheter. Dbl-1 kodar den enda ligand av benmorfogenetiskt protein (BMP) signalväg. sma-3 och sma-10 är gener som kodar SMAD orthologues, viktiga komponenter i BMP signalering kaskad. Dnj-26 kodar ett molekylärt förkläde, ett mål för BMP-signalering. Dessa resultat visar liten eller ingen skillnad i vikförändringen som jämför resultaten av de två metoderna, vilket resulterar i inte signifikanta P-värden vid 0,3113, 0,2635 respektive 0,3481 för sma-3, sma-10och dnj-26, respektive. Sammantaget visar dessa resultat att Worm-to-CT-metoden som tillämpas på bulkprover är ett effektivt och snabbt sätt att extrahera RNA från få maskar och ger tillförlitliga data i kombination med antingen standard PCR-system eller nanofluidikbaserade qPCR-plattformar med hög genomströmning.

Jämförelse mellan de uttrycksnivåer som erhålls genom massprover med medelvärden från enstaka maskar

De relativa uttrycksnivåerna beräknades med hjälp av antingen cDNA som erhållits från bulkprover (25 maskar) eller från i genomsnitt 36 enstaka maskprover(figur 5). Båda cDNAs erhölls med hjälp av Worm-to-CT metoden och förstärks med hjälp av nanofluidics PCR-teknik. Såsom konstaterats i figur 5A–C, för alla testade förkläde (dvs. hsp16.1, F44E5.4, hsp-70),upptäckte metoderna jämförbara uttrycksnivåer. Dessa resultat indikerar att parametrar som erhålls från enstaka maskar är tillförlitliga.

Tillämpning av Worm-to-CT kopplad till nanofluidikteknik för att uppskatta parametrar för genuttryck med en mask

Eftersom chippet med en matris möjliggör övervakning av upp till 96 målutskrifter på 96 enskilda prover är det därför väl lämpat att övervaka individuell variabilitet i transkriptionsuttryck mellan enstaka maskar. Figur 6A presenterar ett representativt resultat som visar det genomsnittliga uttrycket för flera hsp-transkriptioner från enstaka maskar efter en kort värmechock. Som observerats i figuren skilde sig variationen i uttrycket av transkriptioner dramatiskt mellan olika gener (Figur 6A). För att få ytterligare insikt beräknades variationskoefficienten (CV) genom att standardavvikelsen dividerar medelvärdet av uttrycksnivåerna²⁶ (figur 6B). Tre gener vars CV-värden tidigare har uppskattats med alternativa metoder övervakades (opublicerade data). Två stabila transkriptioner (ife-1 och Y45F10D.4) och en variabel (nlp-29²⁷) visade deras förväntade variabilitet. Diagrammet visar också tydligt det välkända omvända förhållandet mellan variabilitetsvärden och uttrycksnivåer²⁶ (figur 6B).

Tekniska replikat är av största vikt för att säkerställa reproducerbarhet vid användning av bulkprover. Detta är dock inte nödvändigtvis fallet för encellsexperiment^14,15,28. För att avgöra om användningen av tekniska replikat är nödvändig för parameteruppskattning vid användning av enmaskprover skördades 28 enskilda maskar efter en kort värmechock och bearbetades med hjälp av tekniska tre exemplar. De CV-värden som beräknats utifrån data med en mask som erhållits i tre exemplar (blå prickar i figur 7, tekniskt CV) jämfört med värdena för varje transkript som erhållits från enskilda maskar (röda punkter i figur 7, biologisk variabilitet) jämfördes. För varje avskrift som testades var de tekniska CV:erna lägre än de biologiska CV:erna, vilket tyder på att tekniska tre exemplar inte krävdes för parameteruppskattning. Det faktum att tekniska replikat inte krävs ökar experimentet utan att kompromissa med kvaliteten.

Figur 1: Översikt över Worm-to-CT-protokollet.
Den här figuren visar en kort översikt över de olika steg som krävs för att köra maskar via Worm-to-CT-protokollet. Två valfria metoder visas för det omvända transkriptionssteget. Dessa är utbytbara metoder för båda typerna av chip. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 2: Översikt över beredning och drift av nanofluidisk qPCR.
Den här figuren visar förberedelser för att köra det nanofluidiska qPCR-systemet med hjälp av ett chip med flera matriser och ett chip med en matris. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 3: Worm-to-CT-protokoll om massprover gav tillförlitliga resultat.
Jämförelse av Worm-to-CT protokoll kontra regelbundna guanidium tiocyanat-fenol-kloroform^{extraktion 22} på bulk prover. I överensstämmelse med tidigare resultat, i hsf-1(sy441)mutanter^23, nivåerna av hsp transkript som svar på värmechock minskade. Ovanstående histogram visar induktion av hsp-70 i avsaknad av (-) eller följande (+) en kort värmestöt på 30 min vid 34 °C. CDNA erhölls med hjälp av guanidium tiocyanate-fenol-kloroform extraktion tillämpas på 1 000 maskar (vänster) eller med hjälp av Worm-to-CT-metoden tillämpas på 30 poolade maskar (höger). Uttrycksnivåerna för hsp-70 per 100 ng av totalt RNA som erhållits med varje metod jämfördes. Som förväntat minskade den transkriptionella induktionen av hsp-70 som svar på värmechock avsevärt med 82,7% med hjälp av guanidium tiocyanat-fenol-kloroform och med 92,3% med hjälp av Worm-to-CT-metoden. MRNA-nivåerna från målgener normaliserades mot genomsnittet av de tre hushållningsgenerna cdc-42, pmp-3, och ire-1. Varje prick representerar en biologisk replikat. Data loggades för statistisk analys, eftersom de inte uppfyllde de konventioner som krävs för parametrisk analys. Statistisk analys gjordes med hjälp av en RM-One-way ANOVA med Sidaks multipla jämförelsetest. Vild typ = N2, hsf-1 = hsf-1(sy441). Staplar betecknar standardfelet för medelvärdet. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 4: Uttrycksmönstren överensstämde mellan standard qPCR- och nanofluidiska qPCR-system.
(A) Uttrycksnivån för sma-3 (A), sma-10 (B) eller dnj-26 (C) mRNA fastställdes genom regelbunden qPCR och nanofluidisk qPCR (multi-array chip) från tre biologiska replikat av cDNA som genereras genom Worm-to CT från den vilda typstammen (N2) och dbl-1(nk3) knockout^{stam 25}. Relativa mRNA uttryck nivåer fastställdes för varje stam med hjälp av Delta-Ct metod²¹. Vikförändringen bestämdes sedan genom att dividera uttrycksnivåerna som erhållits i dbl-1(nk3) maskar med motsvarande mRNA-nivåer i N2-stammen. Som visas i panel Avar mönstren konsekventa för båda metoderna i varje enskild biologisk replikat. (B) och (C) är desamma som (A) för sma-10 respektive dnj-26 mRNA nivåer. Mål mRNA nivåer normaliserades mot hushållningsgenerna cdc-42 och pmp-3. Statistisk analys beräknades för varje gen med hjälp av ett parat t-test som jämförde resultaten av de tre biologiska replikat som produceras genom standard qPCR och de som genereras genom nanofluidisk qPCR. P-värdena för dessa jämförelser var 0,3113, 0,2635 och 0,3481 för sma-3, sma-10respektive dnj-26. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 5: Användning av Worm-to-CT-metoden på bulkprover eller på enstaka maskar gav liknande uttrycksnivåer när de normaliserades per mask.
Uttrycksnivåerna för (A) hsp-16.1/11,(B) F44E5.4 och (C) hsp-70 (C12C8.1) analyserades hos unga vuxna djur i avsaknad av värmechock antingen genom att utföra Worm-to-CT på en bulk av 25 djur, eller på 36 enskilda individer. När data normaliserades per mask fanns det ingen signifikant skillnad mellan nivåer som erhållits per mask för varje transkription med båda metoderna. MRNA nivåer från mål gener normaliserades mot genomsnittet av de tre hushållning gener cdc-42, pmp-3, och ire-1. Staplar representerar standardfelet för medelvärdet. Statistik = parat t-test. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 6: RT-qPCR med hög genomströmning på enstaka maskar med hjälp av Worm-to-CT-metoden kan övervaka variabilitet mellan individer i genuttryck.
a)Medeluttrycksnivåer för 53 transkriptioner som erhålls vid exponering för en kort värmestöt (30 min vid 34 °C). Boxplots representerar fördelningen av genomsnittliga mRNA uttryck från enskilda maskar (i genomsnitt tre tekniska replikat användes per enskild mask). Punkterna representerar uttrycksnivåer i 28 enskilda maskar. MRNA nivåer från mål gener normaliserades mot genomsnittet av de tre hushållning gener cdc-42, pmp-3, och ire-1. B)Variationskoefficienten²⁶ (CV) som en funktion av genomsnittligt mRNA-uttryck för 53 transkript efter exponering för en kort värmechock beräknades från 28 enskilda djur (rådata som visas i panel B). Uppsättningen av transkriptioner inkluderar variabeln nlp-29 transkript²⁷ och två stabila transkriptioner(ife-1 och Y45F10D.4; opublicerade data). CV:t är förhållandet mellan standardavvikelsen och medelvärdet. Detta CV användes för att uppskatta inter-individual variabilitet i transkription uttryck mellan enskilda maskar. Som förväntat skalas variabiliteten mellan individer med minskade genomsnittliga uttrycksnivåer. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Figur 7: Tekniska replikat var inte nödvändiga vid analys av variabilitet mellan individer i genuttryck med hjälp av ett nanofluidiskt chip.
De data som presenteras i detta diagram erhölls i 28 enskilda maskar efter en kort värmechock (30 min vid 34 °C). Varje röd punkt representerar variationskoefficienten (CV) för genomsnittliga transkriptionsuttrycksnivåer för en transkription som analyseras mellan 28 enskilda maskar (bio-CV). Varje blå punkt representerar CV för uttrycksnivåer mellan tre tekniska replikat som erhållits från en enda mask, per avskrift analyserad (tekniskt CV). Detta diagram visar att teknisk variabilitet (mellan tekniska replikat) var mycket lägre än biologisk variabilitet (mellan enskilda maskar), vilket tyder på att det är onödigt att utföra tekniska replikat på en nanofluidisk genuttrycksmatris när man analyserar genuttryck i enstaka maskar, på samma sätt som encellsstudier^14,15,28. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Tabell 1: Planera layouten för ett chip med flera matriser. Tabellen ovan visar en enkel layout som kan användas när du planerar en chipkörning med flera matriser. Till vänster finns de utrymmen som ska fyllas med de främsta målen av intresse och till höger finns utrymmen som ska fyllas med intresseprover. Varje analys- och provmatris paras ihop med nummervis genom chippet. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tabell 2: Planera layouten för ett chip med en matris. Tabellen ovan visar en enkel layout som kan användas när du planerar en chipkörning med en matris. Till vänster finns utrymmen som ska fyllas med primermål av intresse och till höger finns utrymmen som ska fyllas med intresseprover. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tabell 3: Lista över RT-qPCR-primers som används i denna studie. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Kompletterande tabell 1: Primers från databasen över RT-qPCR primers. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Discussion

I det här dokumentet visas Worm-to-CT-protokollet vara en snabb och effektiv metod för att extrahera RNA från enstaka maskar eller en liten pool av maskar. Det höggenomströmning som erbjuds av det nanofluidiska systemet gör det idealiskt för kvantifiering av inter-individuella variabilitetsmätningar. Dessutom tillåter den höga känsligheten hos denna metod detektion av gener uttryckta vid låga nivåer som faller under detektion när du använder RNA-seq-teknik med en mask⁹.

När man överväger valet av metod för att förbereda cDNA från enstaka maskar. Ly et al.^{29 optimerade} ett protokoll som förlitar sig på proteinas K för nagelbands matsmältning. Nagelbandet är ett stort hinder för isolering av molekyler från maskar och proteinas K ger en effektiv metod för att bryta den. Proteinas K måste dock värmeinaktiveras för att kunna använda enzymer för omvänd transkription. Medan Ly et al. använde en 10 min exponering för 96 °C, undveks detta steg i detta protokoll eftersom RNA är lätt nedbrytbart. I stället för att använda proteinas K användes upprepade frys-tina cykler för att bryta nagelband. Frys-tinning är en effektiv metod för att bryta nagelbandet eftersom mer RNA kan isoleras per mask. Ly et al. rapportera att det totala RNA extraheras per mask är 35 ng med proteinas K, medan detta protokoll erhåller 51,75 ng ± 6,74 SEM av totalt RNA per mask. Undvikande av värmeexponering i kombination med föramplifieringssteg breddar tydligen Worm-to-CT:s dynamiska detektionsområde jämfört med standardprotokoll. Ly et al. rapportera absoluta Ct-värden på 21,1 ± 0,15 för hsp-16,2 och 22,8 ± 0,17 för hsp-70 efter värmechock. Med samma värmechocksförhållanden (1 h vid 30 °C) erhåller detta protokoll absoluta Ct-värden på 17,93 ± 0,57 för hsp-16,2 och 21,13 ±0,33 för hsp-70. Detta indikerar att frys-tina lysis metoden ger högre utbyten av RNA och är lämpligare för lågt uttryckta transkriptioner.

Nanofluidiska system är idealiska när man undersöker en viss uppsättning målavskrifter och användningen av antingen mindre (multi-array chip) eller större (single-array chip) antal prover som möjliggör anpassning till experimentens skala. För att få en opartisk bild av alla transkriptioner uttryckta i en enda mask är det uppenbara valet att använda RNA-sekvensering. Men om fokus för experimentet är en mindre men fortfarande relativt stor uppsättning målgener är det mer kostnadseffektivt att använda detta protokoll, förutsatt att forskaren har tillgång till en nanofluidik PCR-maskin. Kostnaden för de nanofluidiska systemreagenserna och ett flischip med en matris uppskattas till cirka £ 13 per mask, medan kostnaderna för reagenserna för enkelmasksekvensering skulle vara cirka £ 60 per mask, exklusive sekvenseringskostnaderna.

När man överväger vilken PCR-plattform som ska användas erbjuder Worm-to-CT-metoden i kombination med nanofluidisk qPCR fördelar när det gäller tid och dataflöde. Det är möjligt att få 9 216 RT-qPCR-resultat på cirka 2 dagars arbete, medan förstärkning av samma antal mål med en standard qPCR-plattform skulle ta cirka 5 arbetsveckor med 96 brunnsplattaanalyser, som kör fyra plattor om dagen. Men om antalet mål som ska testas är mindre är det mer kostnadseffektivt att använda Worm-to-CT tillsammans med en vanlig qPCR-maskin. Det går inte att köra chipsen med en matris igen, så att köra tomma brunnar minskar kostnadseffektiviteten.

En begränsning av metoden är den potentiella bildandet av primer-primer dimers under multiplexeringssteget, men detta sker i mindre än 1% av fallen. Även om Worm-to-CT-protokollet är effektivt och ger tillförlitliga resultat när det appliceras på enstaka maskar, finns det en felfrekvens på cirka 5%, vilket sannolikt motsvarar fall där masken förblir instängd i locket eller toppen av röret under skördesteget.

Tillsammans erbjuder denna mångsidiga och pålitliga metod ökad genomströmning och känslighet jämfört med mer standardtekniker. Denna metod kan vara mycket användbar för validering av höggenomströmningsskärmar och är ett utmärkt val att antingen övervaka eller validera enmaskiga genuttrycksnivåer. Denna metod kan tillämpas på andra utmanande tekniker, såsom kvantifiering av genuttryck från isolerade vävnader. Till exempel ger isolering av fulla vävnader, såsom tarmarna, gonaderna eller cellerna som isolerats av FACs, tillräckligt med material för att utföra RNA-sekvenseringsexperiment. Begränsade mängder material leder dock ofta till duplicerade läsningar, vilket utesluter kvantifiering av sällsynta transkriptioner. I det här scenariot bör användning av nanofluidikbaserad teknik ge ökad känslighet för experimenten och öka kostnadseffektiviteten om forskarna bara behöver övervaka en delmängd av alla transkriptioner i dessa vävnader eller celler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100µM stock primers for genes of interest.
20X DNA Binding Dye	Fluidigm	100-7609	for 96.96 chip (Single-Array Chip)
2X Assay Loading Reagent	Fluidigm	100-7611
384 well plates
8-strip PCR tubes
96 well ice block
96 well plates
96.96 Dynamic Array IFC	Fluidigm	BMK-M-96.96	Referenced throughout the manuscript as "Single-Array Chip"
96-well sealing tape
BioMark & EP1 Software	Fluidigm	101-6793	Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software
BioMark or BioMark HD system	Fluidigm	100-2451 K1	Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics thermocycler"
Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs	Fluidigm	89000021	Referenced throughout manuscript as "control line fluid"
DNA Suspension buffer	TEKnova	T0021
domed PCR caps
Exonuclease I	New England BioLabs	M0293L
Exonuclease I reaction buffer	New England BioLabs	B0293S
FLEXsix DELTAgene Sample Reagent	Fluidigm	100-7673	referenced throughout manuscript as "sample reagent"
FLEXsix Gene Expression IFC	Fluidigm	100-6308	referenced throughout manuscript as "Multi-Array Chip"
Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide	Fluidigm	68000088	This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript.
IFC Controller MX	Fluidigm	68000112 I1	Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics PCR priming machine"
IFC Controllers SOFTWEAR	Fluidigm	100-2297	Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX
liquid nitrogen in dewar
Microcentrifuge	StarLab	C1301B-230V	Used to spin down PCR tube strips in the protocol.
Nuclease Free Water
plate spinner	Labnet	K4050725	mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as "tabletop plate spinner"
Power SYBR Green Cells-to-Ct kit	invitrogen	4402955	This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20°C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR®Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions.
PreAmp Master Mix	Fluidigm	100-5580, 100-5581
Reverse Transcription Master Mix—480 reactions	Fluidigm	100-6299	One tube also available for 96 reactions (PN100-6298)
Rnase Free water
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX	Bio-Rad Laboratories	172-5211	referenced throughout the manuscript as "fluorescent probe supermix"
Standard 96 and 384-well Thermal Cycler
TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA	TEKnova	T0224	Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer
ThermoMixer C	Eppendorf	5382000031	Referenced throughout the text as "thermal mixer"
Trizol	Thermo-Fisher	15596026	Referenced through the protocol as "guanidium thiocyanate-phenol-chloroform"
Warm water bath