Summary
אנו מתארים שלוש שיטות ליצירת פולימרי Ln1 בעלי תכונות פרקטליות המאותתות לתאים באופן שונה בהשוואה ל-Ln1 לא פולימרי.
Abstract
Laminin-111 (Ln1) הוא חלק חיוני של המטריצה החוץ תאית באפיתליה, שרירים ומערכות עצביות. הראינו בעבר שהמיקרו-מבנה של Ln1 משנה את האופן שבו הוא מאותת לתאים, אולי משום שהרכבת Ln1 לרשתות חושפת תחומי דבק שונים. בפרוטוקול זה, אנו מתארים שלוש שיטות ליצירת Ln1 פולימרי.
Introduction
שלא כמו גורמי גדילה או ציטוקינים, חלבוני מטריצה חוץ-תאיים (ECM) יכולים להתאסף לרשתות מבניות. מכיוון שתפקוד לקוי של ECM הוא מרכיב מרכזי במצבי מחלה רבים, המנגנונים שבאמצעותם תאים חשים ומתמרים אותות מהרכב ECM, מיקרו-מבנה וביומכניקה הם מטרות אטרקטיביות לפיתוח טיפולי. עדויות הולכות ומצטברות מצביעות על כך שהמיקרו-מבנה של רשתות אלה ממלא תפקיד מרכזי באופן שבו חלבונים אלה מאותתים לתאים. עד כה, הקשר הזה בין מיקרו-מבנה ECM לבין תפקוד התאים הוכח עבור קולגן I1, פיברונקטין2 ופיברין3.
Laminin-111 (Ln1) הוא חלבון טרימרי בצורת צלב המהווה מרכיב מבני מרכזי במטריצה החוץ תאית שבאה במגע עם תאי אפיתל4, תאי שריר5 ותאים עצביים6. בבלוטת החלב, Ln1 הכרחי להתמיינות תפקודית של תאי אפיתל בלוטת החלב לתאים מייצרי חלב 7,8,9, ו- Ln1 חיוני להשראת היפוך הגידול10,11. Ln1 ולמינינים אחרים נחוצים להתפתחות רשתות אקטין קליפת המוח וארגון סרקולמה בשריר12,13, ולנדידת תאים עצביים וצמיחת נוירונים13 . לפיכך, הבנת המנגנונים שבאמצעותם למינין מאותת לתאים היא תחום מחקר פעיל.
Ln1 מכיל תחומי הדבקה מרובים עבור מגוון רחב של קולטנים, כולל אינטגרינים, סינדקנים, דיסטרופיקן, LBP-110 ו-LamR (איור 1A)4,14. מקטע E8, המכיל את התחומים הכדוריים c-terminus של למינין α1, הכרחי לקשירת דיסטרופיקן ואינטגרינים α6β1 ו- α3β115, והוא הכרחי להתמיינות פונקציונלית של תאי אפיתל 15,16. לעומת זאת, הזרועות הקצרות מראות פעילות ביולוגית שונה17, כלומר זמינות לזיהוי תחומי Ln1 שונים אלה לאחר היווצרות הרשת עשויה לשנות את התנהגות התא.
לאחרונה הראינו כי Ln1 המסודר ברשת פולימרית מציג תכונות פרקטליות (כלומר, מבנה הדומה לעצמו על פני סקאלות אורך מרובות)18. רשתות פרקטליות מאותתות באופן שונה לתאי אפיתל בהשוואה ל- Ln1, אשר חסר סידור זה19. רשת פרקטלית זו מצביעה על מבנה הרכבה מסוים, שבו הזרוע הארוכה חשופה באופן מועדף לתאים18. כתוצאה מתצוגת זרועות ארוכות ושונה זו, תאי אפיתל עוברים התמיינות תפקודית לתאים מייצרי חלב עם צמתים הדוקים מאורגנים היטב ודיכוי סיבי עקה אקטין19.
אנו מתארים 3 שיטות ליצירת רשתות Ln1 מאינטראקציות קשירת זרוע קצרה-זרוע קצרה, אשר מראות תצוגה גבוהה של הזרוע הארוכה Ln1: 1) על ידי הרכבה ללא תאים עם מאגרים חומציים, 2) על ידי דגירה משותפת עם גליקופרוטאינים, או 3) על ידי אינטראקציה עם דיסטרופיקן פני התא. שלוש שיטות אלה מייצרות מיקרו-מבנים דומים של למינינים באמצעות שלושה מנגנונים שונים מאוד, המאפשרים גמישות בתכנון הניסוי. עבודות קודמות מצביעות על כך ששלוש שיטות אלה יכולות לייצג חוסן ביולוגי: באפיתל של בלוטת החלב, דיסטרוגליקן על פני התא, גליקופרוטאינים, או למינין במבנה מלאכותי יכולים לגרום להתמיינות תפקודית19. לפיכך, החוקרים יכולים לבחור בין שיטות אלה בהתבסס על נושא המחקר: תאים המבטאים דיסטרוגליקן אינם מראים רגישות למיקרו-מבנה Ln-1, שכן דיסטרופיקן בקרום התא גורם לפילמור נכון לרשת פרקטלית19,20. Matrigel, תערובת של למינינים וגליקופרוטאינים21, מייצג את המקור החסכוני ביותר של Ln-1, ומציע את המיקרו-מבנה הדרוש כדי לגרום לתאי חלב נוקאאוט דיסטרופיקניים להתמיין20, אך מכיל תערובת מורכבת של חלבונים עם שונות רבה להרבה. PolyLM מייצגת את המערכת הרדוקציוניסטית הנקייה ביותר המספקת פונקציה זו, אך בעלות מוגברת וביעילות נמוכה יותר להשראת התמיינות תאי חלב בהשוואה למטריג'ל19.
לשלוש שיטות אלה מבנה רשת פרקטלי האופייני לצבירה מוגבלת בדיפוזיה18,19, והן מראות פעילות ביולוגית שונה בהשוואה ללמינין מצטבר במערכות ניסוי מרובות 22,23,24,25. מחקרים עתידיים המשתמשים בשיטות אלה יוכלו לזהות את הקולטנים והאיתות הדרושים להתמיינות אפיתל ולקבוע לשחזר אינטראקציות נורמליות בין מטריצת תאים בתאים במיקרו-סביבות חריגות20, כגון גידולים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הפשרה ו aliquot laminin-111
הערה: למינין-111 מטוהר זמין באופן מסחרי (בדרך כלל מטוהר ממטריצת EHS שנמכרת כמטריג'ל), אך לא כל המקורות מספקים חלבון שלם ולא מתפרק.
- ודא כי Ln1 אינו פגום על ידי מיקור Ln1 והפעלת גודל לא כולל כרומטוגרפיה26 או אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד26. ל-Ln1 מפורק צריכות להיות רצועות ב-337 kDa, 197 kDa ו-177 kDa, ול-Ln1 מקורי צריכה להיות להקה אחת ב-711 kDa.
- הפשירו Ln1 על קרח במקרר למשך הלילה, והכניסו אותו לצינורות מיקרו-צנטריפוגות דלות חלבון (בדרך כלל aliquot ב-100 מיקרוגרם לשפופרת עבור שכבות-על של תרבית, או 10 מיקרוגרם עבור ציפויים) באמצעות קצוות קשירת חלבון נמוכים וטכניקה סטרילית27. להקפיא aliquots ולאחסן ב -80 °C.
2. פילמור למינין באמצעות מאגרי pH נמוכים
- צור חיץ פילמור polyLM: שקול וערבב 1 mM CaCl2 ו 20 mM נתרן אצטט במים טהורים במיוחד. לאחר מכן להתאים את ה- pH ל 4.0, באמצעות HCl או חומצה אצטית. מסננים סטריליים דרך מסנן 0.2 מיקרומטר, ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C.
- צור חיץ פילמור בקרה: ערבב 1 mM CalCl2 ו- 20 mM Tris וכוונן את ה- pH ל- 7.0, באמצעות 10 N HCl או 12 N NaOH לפי הצורך. מסננים סטריליים דרך מסנן 0.2 מיקרומטר, ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C.
הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן. - הפשירו את המספר הדרוש של אליציטוטים Ln-1 במקרר למשך הלילה.
- באמצעות טכניקת תרבית תאים סטרילית, הוסף את המאגר המתאים (או חיץ פילמור פוליLM משלב 2.1 או חיץ פילמור בקרה משלב 2.2) לאליציטוטים למינין בריכוז סופי של 100 מיקרוגרם / מ"ל (כלומר הוסף 0.5 מ"ל ל 50 מיקרוגרם aliquots) וערבב בעדינות על ידי pipetting.
- אם אתם משתמשים בלמינין עם תווית פלואורסצנטית להמחשה, יש ליצור מחדש ולהוסיף ביחס של 1:50 wt/wt (לדוגמה, 2 מיקרוגרם/100 מיקרוגרם) ולערבב בעדינות באמצעות פיפט.
הערה: אם אתה משתמש בלמינינים כמצע עבור קובץ מצורף לתא, בצע את שלבים 2.6-2.8: - מיד לאחר דילול בחיץ מתאים, מעבירים למינינים לתרבית פלסטיק או כלי זכוכית ודגרים לילה באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. שימו לב שבעת ציפוי כיסויים, הוסיפו נפח גדול מספיק כדי ליצור טיפה מאוזנת (בדרך כלל, השתמשו ב-50 מיקרוליטר לכיסוי עגול של 13 מ"מ), ושמרו בתא לח למשך הלילה בטמפרטורה של 37°C.
- בטכניקה סטרילית27, יש לשטוף במי מלח חוצצים פוספט 1x (PBS).
- מוציאים את הנוזל בזהירות. אין לאפשר למשטח להיות יבש לחלוטין.
הערה: אם אתה משתמש בלמינינים לכיסוי תאים להשראת חלבון חלב, בצע את השלבים 2.9-2.12: - תרבית תאי אפיתל החלב. תרבית תאי דיסטרוגליקן מסוג MepG (DgKI) או תאי נוקאאוט דיסטרוגליקן MepG (DgKO) בתאי DMEM-F12 בתוספת 2% FBS, 0.01 מ"ג/מ"ל אינסולין, 0.005 מיקרוגרם/מ"ל EGF, 0.05 מ"ג/מ"ל גנטמיצין ו-0.05 גרם/מ"ל נורמוצין.
- זרע DgKO ו DgKI תאים לגירוי למינין ב 10,500 תאים / ס"מ2 בצלחות באר או לכסות כלים תחתונים
- לדגור על למינינים מדוללים באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37°C למשך 30 דקות.
- צנטריפוגה polyLM aliquots ב 2,000 x גרם במשך 20 דקות, אבל צנטריפוגה LM ב pH ניטרלי ב 20,000 x גרם במשך 20 דקות בשל גודל קטן יותר של ישויות חלבון צורך מהירויות גבוהות יותר לאסוף ביעילות.
- באמצעות טכניקה סטרילית27, להסיר את supernatant בעדינות, ולהשהות מחדש בנפח מתאים של אמצעי השראה של DMEM-F12 בתוספת 3 מיקרוגרם / מ"ל פרולקטין, 2.8 מיקרומטר הידרוקורטיזון, ו 5 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין
- העבר למינין בתווך תרבית התא באופן מיידי כדי לעורר תאים. גירינו בהצלחה תאים עם 50-800 מיקרוגרם/מ"ל Ln1
3. פילמור למינין באמצעות גליקופרוטאינים מבודדים
- הפשירו בעדינות nidogen-1 ו-Ln1 רקומביננטיים על קרח במקרר למשך הלילה.
- ערבבו את Ln1 עם nidogen-1 ביחס של 1:1 wt/wt בתווך תרבית תאים תוך שימוש בקצוות ובצינורות דלי קשירת חלבונים ובטכניקה סטרילית. השתמש ב- Ln1 טהור במדיום תרבית תאים כבקרה.
- אם אתה משתמש בלמינין מתויג פלואורסצנטית לתצוגה חזותית, צור מחדש והוסף ביחס של 1:50 wt/wt (לדוגמה, 2 מיקרוגרם/100 מיקרוגרם). מערבבים בעדינות על ידי פיפט.
- לדגור על Ln1-nidogen או לשלוט Ln1 באינקובטור תרבית תאים ב 37 ° C במשך 30 דקות.
- צנטריפוגה Ln1-nidogen קופולימרים ב 2,000 x גרם במשך 30 דקות ואת הבקרה Ln1 ב 20,000 x גרם במשך 30 דקות.
- מסירים בעדינות את הסופרנאטנט ומשהים מחדש בתווך תרבית התאים לריכוז סופי של 100-800 מיקרוגרם סה"כ חלבון/מ"ל.
- יש להשתמש מיד כדי לעורר תאים, או להעביר לכיסויים ולאפשר להיצמד למשך הלילה לטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באינקובטורים של תרביות תאים לחות.
- יש להסיר את מדיום התרבית מהכיסויים, לשטוף את הכיסויים עם 1x PBS, ולאחר מכן לתקן עם 10% פורמלין (כלומר, 4% פורמלדהיד ב-PBS) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
4. פילמור למינין באמצעות תאים המבטאים דיסטרוגליקן
- תרבית תאי אפיתל החלב. תרבית תאי דיסטרוגליקן מסוג MepG (DgKI) או תאי נוקאאוט דיסטרוגליקן MepG (DgKO) בתאי DMEM-F12 בתוספת 2% FBS, 0.01 מ"ג/מ"ל אינסולין, 0.005 מיקרוגרם/מ"ל EGF, 0.05 מ"ג/מ"ל גנטמיצין ו-0.05 גרם/מ"ל נורמוצין.
- תאי DgKI זרעים ב-5,000 תאים לסמ"ק2, ותאי DgKO זרעים ב-8,000 תאים לסמ"ק2 עקב הבדלים בקצב הצמיחה. תרבית ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטורים לחים עם שינויי מדיה כל 2-3 ימים ומעברים כל 4-5 ימים באמצעות טכניקה סטרילית קפדנית. ספור תאים בזהירות עם המוציטומטר או מונה תאים אוטומטי27 כדי להבטיח קצבי גדילה מתאימים.
- תאי זרעים לגירוי למינין ב 10,500 תאים / ס"מ2 בצלחות באר או לכסות כלים תחתונים ותרבית במשך יומיים, באמצעות תאי DgKI כדי לייצר תאי Ln1 ו- DgKO פרקטליים כבקרות שליליות. יש להפשיר את Ln-1 בעדינות למשך הלילה על קרח במקרר, ולאחר מכן לערבב עם מצע אינדוקציה של DMEM-F12 בתוספת פרולקטין של 3 מק"ג/מ"ל, הידרוקורטיזון של 2.8 מיקרומטר ואינסולין של 5 מק"ג/מ"ל. עבור צלחת 35 מ"מ, השתמש 1 מ"ל של מדיה אינדוקציה עם 50-800 מיקרוגרם של Ln1.
- אם אתם משתמשים ב-Ln1 פלואורסצנטי, ערבבו ביחס של 50:1 wt/wt.
- יש להסיר מדיה מהתאים, ולכסות בלמינין ובאמצעי אינדוקציה של DMEM-F12 בתוספת פרולקטין של 3 מיקרוגרם/מ"ל, הידרוקורטיזון של 2.8 מיקרומטר ואינסולין של 5 מק"ג/מ"ל
- תאים תרבית במשך 2 ימים, ולאחר מכן לתקן עם 10% פורמלין.
5. אפיון מיקרו-מבנה למינין באמצעות מיקרוסקופ אופטי
- אספו דגימות קבועות ושטפו 3 פעמים עם 1x PBS בטמפרטורת החדר למשך 5 דקות.
- יש לחסום ולחדור דגימות ב-PBS 1x עם 0.5% Triton X-100, אלבומין בסרום 3% בקר, 10% סרום עיזים ומקטע נוגדנים חוסם נגד עכבר 40 מיקרוגרם/מ"ל למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר בתא לח.
הערה: Triton X-100 מסוכן. יש לטפל עם כפפות והגנה על העיניים ולהיפטר בהתאם. - יש לערבב נוגדן אנטי-למינין בדילול של 1:100 עם 1x PBS עם 0.5% Triton X-100 ו-3% BSA ולהוסיף לדגימות במשך שעתיים בטמפרטורת החדר או למשך הלילה ב-4°C בתא לח (בדרך כלל להשתמש בקופסאות קצה עם מגבון מעבדה רטוב בתחתית).
- יש להסיר את הנוגדן הראשוני ולשטוף 3 פעמים עם PBS אחד עם 0.5% Triton X-100 ו-3% BSA.
- יש להוסיף נוגדן משני מתאים בדילול של 1:500 לדגימות ב-1x PBS עם 0.5% Triton X-100 ו-3% BSA ולדגור בטמפרטורת החדר בחושך בתא לח.
- יש להסיר נוגדנים משניים ולשטוף 3 פעמים עם 1x PBS עם 0.5% Triton X-100 ו-3% BSA.
- עבור דגימות המכילות תאים, יש להוסיף פאלואידין 6 מיקרומטר למשך 45 דקות, לאחר מכן 3 שטיפות עם PBS עם 0.5% Triton X-100 ו-3% BSA, ולאחר מכן 3 שטיפות עם PBS. לאחר מכן יש להכתים עם 0.1 מיקרוגרם/מ"ל DAPI ב-PBS למשך 5 דקות.
- הר דוגמאות במידת הצורך.
- מבנה תמונה ln-1 באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי ברזולוציה גבוהה. השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר המצויד במטרות טבילה (תוכנית טבילה במים Apochromat 40X/1.1NA או טבילת שמן Plan Apochromat 63X/1.4NA).
6. אפיון מבני למינין באמצעות ממד ספירת קופסאות
- נתח תכונות פרקטליות באמצעות אלגוריתמים של ממדי ספירת קופסאות הזמינים בארגזי הכלים של Matlab או ב- ImageJ. שיטות אלה מציבות תמונות סף של למינין והתוויית יומן בהתוויית יומן את מספר התיבות המכילות Ln1 בהשוואה לגודל התיבות. שיפוע היחסים בין פרמטרים אלה הוא ממד ספירת הקופסאות: גאומטריות לא פרקטליות יהיו בעלות ממד של 0, 1 או 2, בעוד שגיאומטריות פרקטליות יהיו בעלות ממד לא שלם28.
הערה: ל-Ln1 המחובר לתאי DgKI המטופלים בחומצה, מטופלים בגליקופרוטאין ומחוברים לתאי DgKI יש ממד פרקטלי של ~1.7, בעוד של-Ln1 הבקרה יש ממד פרקטלי של 2.0.
7. אפיון מבני למינין באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים
- להשהות למינינים במדיה תרבית תאים ולאפשר לספוח פרוסות סיליקה במשך 90 דקות בסביבה לחה 37 ° C.
- תקן מטריצות ב 2.5% גלוטראלדהיד ב 0.1 M נתרן cacodylate חיץ ב pH 7.2.
הערה: גלוטראלדהיד הוא מסוכן ויש לטפל בו במכסה אדים עם כפפות והגנה על העיניים ולהשליך אותו כפסולת מסוכנת. - מטריצות Postfix ב 1% osmium tetroxide ב 0.1 M נתרן cacodylate חיץ ב pH 7.2.
הערה: אוסמיום טטרוקסיד הוא מסוכן ויש לטפל בו במכסה אדים עם כפפות והגנה על העיניים ולסלק אותו כראוי. Cacodylate הוא מסוכן ויש לטפל בו במכסה מנוע עם כפפות והגנה על העיניים ולהיפטר ממנו כראוי. - יש לשטוף 3 פעמים במאגר נתרן קקודילט ב-pH 7.2.
- להתייבש עם ריכוזים הולכים וגדלים של אתנול.
- מפזרים מטריצות מעיל עם שכבה דקה של זהב.
- תמונה באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laminin-111 הוא חלבון טרימרי עם שלושה תחומי הרכבה עצמית בקצה זרועותיו הקצרות (איור 1A). כאשר הן מטופלות כראוי, הזרועות הקצרות יכולות להתפלמר לסריג משושה (איור 1B,1C), אשר מציג תכונות פרקטליות אגרגטיביות מוגבלות דיפוזיה בסקאלות מרחביות גדולות יותר (איור 2). למינין המודגר במאגרי pH נייטרלי המכילים סידן יוצר אגרגטים קטנים עם נוגדן אנטי-Ln1 (איור 2A), שיש להם ממד פרקטלי של ~2, מה שמצביע על כך שאין פרקטליות. לעומת זאת, Ln1 מודגר במאגר pH4 המכיל סידן (איור 2B), או בחיץ נייטרלי עם נידוגן-1 (איור 2C) יוצר רשתות תחרה הממלאות חלל עם ממד פרקטלי של ~1.7 (איור 3). Ln1 בתרבית עם תאים המבטאים דיסטרוגליקן יוצר רשתות תחרה דומות (איור 2D, שיבוץ מראה גרעיני תאים).
כאשר pH7Ln ו- polyLM מצולמים עם SEM ברזולוציה הולכת וגדלה, ההבדלים במיקרו-מבנה הופכים ברורים יותר. ברזולוציה נמוכה (איור 2Ei ו-v), רשתות polyLM נראות מפוזרות יותר בהשוואה ל-pH7-Ln, וברזולוציה גבוהה ניתן לראות צברי pH7-Ln (איור 2E iv) ואילו סריג משושה מפוזר ניתן לראות ב-polyLM ברזולוציה גבוהה (איור 2E viii).
איור 1: רקע של Ln1 ושיטת פילמור: תשובה: Ln1 הוא חלבון טרימרי מורכב בעל תחומי דבק מרובים (אתרי קשירת קולטנים שצוינו), אשר יכול לקשור מגוון קולטני אינטגרין ושאינם אינטגרין (בשחור) וליצור רשתות פולימריות על ידי קשירת זרועות קצרות זרוע (בשיזוף). B: Ln1 יכול ליצור סריג משושה בנוכחות יוני סידן או pH נמוך, גליקופרוטאינים כגון nidogen-1 או dystroglycan פני התא. C: תמונת SEM לדוגמה של Ln1 פולימרי המציגה סריג משושה ומודל הרכבה מוצע של Ln1. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: נתונים מייצגים עבור פילמור Ln1. ת: Ln1 מצטבר במאגרים ניטרליים עם סידן. כאשר דמיינו זאת עם נוגדן אנטי-Ln1, ניתן לראות אגרגטים קטנים. B: Ln1 בסידן חומצי המכיל חיץ מתפלמר לפוליLM, אשר מראה תכונות פרקטליות. C: תערובת Ln1- nidogen-1 (1:1 wt/wt) יוצרת פולימרים דומים. D: Ln1 במדיה ניטרלית של תרבית תאים חוצצת על גבי תאים המבטאים דיסטרופיקן מראה רשת תחרה דומה. כניסה: צביעה נגדית גרעינית המראה מורפולוגיה של התא. E: סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים של רשתות pH7-Ln ופוליLM (שיטת ספין דאון) ברזולוציה הולכת וגדלה. ב- pH7-Ln, סריקות ברזולוציה נמוכה (i ו- ii) מראות סיבים קומפקטיים יחסית, הנפתרים כאגרגטים בסריקות ברזולוציה גבוהה (iii). polyLM באותו ריכוז הוא הרבה יותר מפוזר (iv&v), וסריקות ברזולוציה גבוהה מראות סריג משושה, מילוי חלל (vii). F: שינוי מיקרו-מבני זה גורם לתאי אפיתל של בלוטת החלב DgKO להתמיין באופן פונקציונלי לתאים מייצרי חלב19. i: תאים מעוררי pH7-Ln מראים שפע של סיבי עקה אקטין (אדום) ו-zo-1 לא מאורגן המכיל צמתים הדוקים (ירוק), ואילו ii: תאים מעוררי polyLM מכילים פחות אקטין נימה כולל, לוקליזציה צידית של אקטין לתוך גבול התא-תא ו-zo-1 מאורגן היטב המכיל צמתים הדוקים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: הערכת ממד פרקטלי בשיטת ספירת הקופסאות. A&B: תמונה גולמית של pH7-Ln ופוליLM מראה הבדלים במורפולוגיה. C&D: תמונות אלה מוחזקות כדי ליצור תמונה בשחור-לבן, E&: ואז מחושב יומן היחס בין מספר התיבות המכילות את התמונה לגודל התיבה. השיפוע הממוצע מייצג את ממד ספירת הקופסאות המחושב Fd. ל- pH7-Ln יש ממד אופייני של 2.0, המציין שאין תכונות פרקטליות, ואילו ל- polyLM יש ממד של ~1.7, המעיד על תהליך צבירה מוגבל בדיפוזיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למינינים מייצגים מרכיב מרכזי של ECM במערכות אפיתל, שרירים ואיברים עצביים, והוכחו במבחנה כממלאים תפקידים חיוניים בוויסות ההתמיינות התפקודית של תאים. עדויות הולכות ומצטברות מצביעות על כך שמבנה הלמינין המוצג לתאים מווסת את האיתות שלו ואת פנוטיפ התא15,16 המתקבל כתוצאה מכך, ולכן שיטות לשליטה במיקרו-מבנה Ln1 צריכות לעניין ביולוגים בסיסיים העובדים בתחומים אלה, ולמהנדסי רקמות המבקשים לשחזר התנהגות נורמלית במבחנה. באופן כללי יותר, המיקרו-מבנה של מגוון חלבוני מטריצה חוץ-תאיים ידוע כמווסת תגובה ביולוגית והבנת המנגנונים שבאמצעותם מיקרו-מבנה מווסת את תפקוד התא היא תחום מחקר פעיל.
בעבודה זו, אנו מתארים שלוש שיטות לפילמור למינין לרשתות עם מיקרו-מבנה פרקטלי האופייני לצבירה מוגבלת בדיפוזיה. פולימרי Ln1 אלה הוכחו כמאותתים באופן שונה לתאים בהשוואה ל-Ln1 מצטבר, אולי עקב שינוי בתצוגת תחום ההדבקה לתאים. שלוש שיטות אלה לשליטה במיקרו-מבנה Ln1 עשויות לייצג יתירות ביולוגית בהרכבה של Ln1, אך הדבר מהווה אתגר לעבודה ניסיונית. שליטה במיקרו-מבנה Ln1 באמצעות טיפול בחיץ חומצי תראה השפעות רק כאשר מוסיפים אותה לתאי נוקאאוט דיסטרופיקנים 19,20. לפיכך, תכנון ניסויי חייב לקחת בחשבון את התאים ואת הטוהר של Ln1 לשימוש. Ln1 זמין מסחרית נגזר בדרך כלל ממטריצת EHS, המכילה אחוז גבוה של נידוגנים וגליקופרוטאינים אחרים; Ln1 במטריצת EHS מתפלמר כראוי לרשתות פרקטליות במערכות אגירה ניטרליות. רקומביננטי Ln1 הפך לאחרונה זמין מסחרית אבל הוא יקר במיוחד.
איכות חלבון Ln1 חיונית לעבודה זו מכיוון שקטעי זרועות קצרות יכולים לחסום פילמור. שברי זרועות קצרות (כלומר, מקטע E4) מפריעים להיווצרות הרשת כאשר כל מקטע גורם לריק ברשת29. נתונים קודמים מראים כי הכללת מקטעי E4 יכולה לחסום פנוטיפים המושרים על ידי Ln129,30. כמו כן, מצאנו כי היווצרות הרשת מופרעת על ידי כמויות קטנות של למינין-332 (נתונים שלא פורסמו), אשר כמו קטעי E4 מכיל תחום דבק יחיד29,30. לכן, חיוני לבדוק כי Ln1 הוא שלם, מטוהר מאוד כדי להסיר מיני למינינים אחרים לפני תחילת העבודה.
בעוד ששיטות אלה רלוונטיות לחוקרים החוקרים אינטראקציות בין מטריצות תאים, יש לציין כי משפחת הלמינינים מורכבת מאוד, וכוללת 15 חברים ידועים וגרסאות נוספות של Splice31, ומשפחה זו מקיימת אינטראקציה עם מגוון רחב של קולטנים, גליקופרוטאינים, קולגנים וגורמי גדילה פוטנציאליים4. לפיכך, Ln1 פולימרי מייצג מצב רדוקציוניסטי אשר ניתן לצפות לשינוי מהיר על ידי תפקוד התא. יתר על כן, מערכות איברים שונות חשות, מגיבות ומשפצות למינינים באופן שונה: הוכחנו כי קישור של למינין לאקטין באמצעות דיסטרופיקן הוא הכרחי עבור בלוטת החלב19, בעוד שדיסטרופיקן הכרחי לחלוטין לתפקוד מיוציטים32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
עבודה זו בוצעה בחסות משרד האנרגיה של ארצות הברית על ידי המעבדה הלאומית לורנס ליברמור תחת חוזה DE-AC52-07NA27344. שחרור IM LLNL-JRNL-799443.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי המעבדה הלאומית לורנס ליברמור LDRD 18-ERD-062 (ל- C.R). תודה לג'ון מושלר על תרומתו האדיבה לתאי DgKO ו- DgKI. תודה לצוות המעבדה למיקרוסקופ אלקטרונים באוניברסיטת קליפורניה בברקלי על ייעוץ וסיוע בהכנת דגימות מיקרוסקופיית אלקטרונים ואיסוף נתונים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Anti-Laminin primary antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody | Thermo | A32731 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 or similar | |
| Cell Culture Incubator | Thermo | Heracell 150 or similar | |
| Centrifuge for microcentrifuge tubes | Eppendorf | 5418 or similar | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 or equivalent | |
| Coverslips | Thermo | 25CIR-1 or similar | |
| DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red | Thermo | 11330107 | |
| EGF (Epidermal Growth Factor) | Sigma Aldrich | 11376454001 | |
| Fluorescently Labeled Laminin | Cytoskeleton Inc | LMN02 | |
| Gentamicin | VWR | VWRV0304-10G | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 or similar | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888-5G | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 16634-50mg | |
| MepG Dystroglycan Knockout Cells | LBNL | N/A | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 or similar | |
| Normocin | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma Aldrich | 75633 | |
| Ovine Prolactin | Los Angeles Biomedical Research Institute | Ovine Pituitary Prolactin | |
| Phalloidin | Thermo | A22287 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo | 10010023 or similar | |
| Purified Laminin-111 | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| Recombinant human Nidogen-1, carrier free | R&D systems | 2570-ND-050 | |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | S2889 or similar | |
| Sodium Cacodylate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Sterile filters | Millipore | SLGP033RS or similar | |
| Tris | Sigma Aldrich | 252859 or similar | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Ultra-low protein binding tubes | VWR | 76322-516, 76322-522 or similar | |
| Ultrapure water | Thermo | 15230253 or similar |
References
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Wang, K., et al. Stiffening and unfolding of early deposited-fibronectin increase proangiogenic factor secretion by breast cancer-associated stromal cells. Biomaterials. 54, 63-71 (2015).
- Bruekers, S. M. C., et al. Fibrin-fiber architecture influences cell spreading and differentiation. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 495-504 (2016).
- Yurchenco, P. D. Integrating Activities of Laminins that Drive Basement Membrane Assembly and Function. Curr Top Membr. 76, 1-30 (2015).
- Colognato, H., Winkelmann, D. A., Yurchenco, P. D. Laminin Polymerization Induces a Receptor-Cytoskeleton Network. The Journal of Cell Biology. 145 (3), 619-631 (1999).
- Powell, S. K., Kleinman, H. K. Neuronal laminins and their cellular receptors. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 29 (3), 401-414 (1997).
- Li, M. L., et al. Influence of a reconstituted basement membrane and its components on casein gene expression and secretion in mouse mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (1), 136-140 (1987).
- Fiore, A., et al. Laminin-111 and the Level of Nuclear Actin Regulate Epithelial Quiescence via Exportin-6. Cell Rep. 19 (10), 2102-2115 (2017).
- Inman, J. L., Robertson, C., Mott, J. D., Bissell, M. J. Mammary gland development: cell fate specification, stem cells and the microenvironment. Development. 142 (6), 1028-1042 (2015).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
- Furuta, S., Ren, G., Mao, J. -H., Bissell, M. J. Laminin signals initiate the reciprocal loop that informs breast-specific gene expression and homeostasis by activating NO, p53 and microRNAs. eLife. 7, 26148 (2018).
- Brown, S. C., et al. Dystrophic phenotype induced in vitro by antibody blockade of muscle alpha-dystroglycan-laminin interaction. Journal of Cell Science. 112 (2), 209 (1999).
- Calof, A. L., Campanero, M. R., O'Rear, J. J., Yurchenco, P. D., Landert, A. D. Domain-specific activation of neuronal migration and neurite outgrowth-promoting activities of laminin. Neuron. 13 (1), 117-130 (1994).
- Li, S., et al. Laminin-sulfatide binding initiates basement membrane assembly and enables receptor signaling in Schwann cells and fibroblasts. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 179-189 (2005).
- Sonnenberg, A., et al. Integrin recognition of different cell-binding fragments of laminin (P1, E3, E8) and evidence that alpha 6 beta 1 but not alpha 6 beta 4 functions as a major receptor for fragment E8. The Journal of Cell Biology. 110 (6), 2145-2155 (1990).
- Sorokin, L., Sonnenberg, A., Aumailley, M., Timpl, R., Ekblom, P. Recognition of the laminin E8 cell-binding site by an integrin possessing the alpha 6 subunit is essential for epithelial polarization in developing kidney tubules. The Journal of Cell Biology. 111 (3), 1265-1273 (1990).
- Horejs, C. -M., et al. Biologically-active laminin-111 fragment that modulates the epithelial-to-mesenchymal transition in embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5908-5913 (2014).
- Hochman-Mendez, C., Cantini, M., Moratal, D., Salmeron-Sanchez, M., Coelho-Sampaio, T. A Fractal Nature for Polymerized Laminin. PLOS ONE. 9 (10), 109388 (2014).
- Kent, A. J., et al. The microstructure of laminin-111 compensates for dystroglycan loss in mammary epithelial cells in downstream expression of milk proteins. Biomaterials. 218, 119337 (2019).
- Weir, M. L., et al. Dystroglycan loss disrupts polarity and beta-casein induction in mammary epithelial cells by perturbing laminin anchoring. Journal of Cell Science. 119, Pt 19 4047-4058 (2006).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Palmero, C. Y., et al. The follicular thyroid cell line PCCL3 responds differently to laminin and to polylaminin, a polymer of laminin assembled in acidic pH. Molecular and Cellular Endocrinology. 376 (1), 12-22 (2013).
- Hochman-Mendez, C., Lacerda de Menezes, J. R., Sholl-Franco, A., Coelho-Sampaio, T.
- Leal-Lopes, C., Grazioli, G., Mares-Guia, T. R., Coelho-Sampaio, T., Sogayar, M. C. Polymerized laminin incorporation into alginate-based microcapsules reduces pericapsular overgrowth and inflammation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 13 (10), 1912-1922 (2019).
- Paccola Mesquita, F. C., Hochman-Mendez, C., Morrissey, J., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Laminin as a Potent Substrate for Large-Scale Expansion of Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Closed Cell Expansion System. Stem Cells International. 2019, 9 (2019).
- Walker, J. M. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 61-67 (2002).
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques. 7th edition. , John Wiley and Sons. (2016).
- Mandelbrot, B. The Fractal Geometry of Nature. , WH Freedman and Company. (1982).
- Schittny, J. C., Yurchenco, P. D. Terminal short arm domains of basement membrane laminin are critical for its self-assembly. Journal of Cell Biology. 110 (3), 825-832 (1990).
- Schuger, L., Yurchenco, P., Relan, N. K., Yang, Y. Laminin fragment E4 inhibition studies: basement membrane assembly and embryonic lung epithelial cell polarization requires laminin polymerization. International Journal of Developmental Biology. 42 (2), 217-220 (1998).
- Colognato, H., Yurchenco, P. D. Form and function: the laminin family of heterotrimers. Developmental Dynamics. 218 (2), 213-234 (2000).
- Kabaeva, Z., Meekhof, K. E., Michele, D. E. Sarcolemma instability during mechanical activity in Large myd cardiac myocytes with loss of dystroglycan extracellular matrix receptor function. Human Molecular Genetics. 20 (17), 3346-3355 (2011).
