Summary
We beschrijven drie methoden om Ln1-polymeren te genereren met fractale eigenschappen die anders naar cellen signaleren in vergelijking met niet-gepolymeriseerd Ln1.
Abstract
Laminine-111 (Ln1) is een essentieel onderdeel van de extracellulaire matrix in epitheel-, spier- en neurale systemen. We hebben eerder aangetoond dat de microstructuur van Ln1 de manier verandert waarop het signalen naar cellen geeft, mogelijk omdat Ln1-assemblage in netwerken verschillende lijmdomeinen blootlegt. In dit protocol beschrijven we drie methoden om gepolymeriseerd Ln1 te genereren.
Introduction
In tegenstelling tot groeifactoren of cytokinen, kunnen extracellulaire matrix (ECM)-eiwitten zich samenvoegen tot structurele netwerken. Aangezien ECM-disfunctie een sleutelelement is van veel ziektebeelden, zijn de mechanismen waarmee cellen signalen van ECM-samenstelling, microstructuur en biomechanica waarnemen en transduceren aantrekkelijke doelwitten voor therapeutische ontwikkeling. Er zijn steeds meer aanwijzingen dat de microstructuur van deze netwerken een belangrijke rol speelt in de manier waarop deze eiwitten signalen naar cellen geven. Tot op heden is dit verband tussen ECM-microstructuur en celfunctie aangetoond voor collageen I1, fibronectine2 en fibrine3.
Laminine-111 (Ln1) is een trimerisch, kruisvormig eiwit dat een belangrijk structureel onderdeel is van de extracellulaire matrix die contact maakt met epitheelcellen4, spiercellen5 en neurale cellen6. In de borstklier is Ln1 nodig voor functionele differentiatie van borstklierepitheelcellen in melkproducerende cellen 7,8,9, en Ln1 is cruciaal voor inductie van tumorreversie10,11. Ln1 en andere laminines zijn nodig voor de ontwikkeling van corticale actinenetwerken en sarcolemma-organisatie in spier12,13, en voor neurale celmigratie en uitgroei van neurieten13. Het begrijpen van de mechanismen waarmee laminine signalen naar cellen stuurt, is dus een actief onderzoeksgebied.
Ln1 bevat meerdere adhesieve domeinen voor een breed scala aan receptoren, waaronder integrinen, syndecanen, dystroglycaan, LBP-110 en LamR (Figuur 1A)4,14. Het E8-fragment, dat de c-terminus bolvormige domeinen van laminine α1 bevat, is nodig voor het binden van dystroglycaan en integrinen α6β1 en α3β115, en het is noodzakelijk voor functionele differentiatie van epitheelcellen 15,16. Daarentegen vertonen de korte armen verschillende biologische activiteit17, wat betekent dat de beschikbaarheid voor herkenning van deze verschillende Ln1-domeinen na netwerkvorming het celgedrag zou kunnen veranderen.
We hebben onlangs aangetoond dat Ln1 gerangschikt in een polymeer netwerk fractale eigenschappen vertoont (d.w.z. een structuur die op meerdere lengteschalen op elkaar lijkt)18. Fractale netwerken signaleren anders naar epitheelcellen in vergelijking met Ln1, dat deze rangschikking mist19. Dit fractale netwerk duidt op een bepaalde assemblagestructuur, waarbij de lange arm bij voorkeur wordt blootgesteld aan cellen18. Als gevolg van deze andere weergave van de lange arm ondergaan epitheelcellen functionele differentiatie tot melkproducerende cellen met goed georganiseerde tight junctions en onderdrukking van actine-stressvezels19.
We beschrijven 3 methoden om Ln1-netwerken te genereren uit korte arm-korte arm bindingsinteracties, die een hoge weergave van de Ln1 lange arm laten zien: 1) door celvrije assemblage met zure buffers, 2) door co-incubatie met glycoproteïnen, of 3) door interactie met dystroglycaan op het celoppervlak. Deze drie methoden genereren vergelijkbare laminine-microstructuren via drie zeer verschillende mechanismen, waardoor flexibiliteit in experimenteel ontwerp mogelijk is. Eerder werk suggereert dat deze drie methoden biologische robuustheid zouden kunnen vertegenwoordigen: in borstklierepitheel, ofwel dystroglycaan op het celoppervlak, glycoproteïnen of kunstmatig gestructureerd laminine kunnen functionele differentiatie induceren19. Onderzoekers kunnen dus kiezen tussen deze methoden op basis van de proefpersoon: dystroglycaanexpressiecellen vertonen geen gevoeligheid voor Ln-1-microstructuur, aangezien dystroglycaan in het celmembraan de juiste polymerisatie induceert in een fractalnetwerk 19,20. Matrigel, een mix van laminines en glycoproteïnen21, vertegenwoordigt de meest economische bron van Ln-1 en biedt de noodzakelijke microstructuur om dystroglycaan knock-out borstcellen te induceren om20 te differentiëren, maar bevat een complex mengsel van eiwitten met veel variabiliteit. PolyLM vertegenwoordigt het schoonste, meest reductionistische systeem dat deze functie biedt, maar tegen hogere kosten en een lagere werkzaamheid om borstceldifferentiatie te induceren in vergelijking met Matrigel19.
Deze drie methoden hebben een fractale netwerkstructuur die kenmerkend is voor diffusiebeperkte aggregatie18,19, en vertonen een veranderde biologische activiteit in vergelijking met geaggregeerd laminine in meerdere experimentele systemen 22,23,24,25. Toekomstige studies met behulp van deze methoden zouden de receptoren en signalering kunnen identificeren die nodig zijn voor epitheliale differentiatie en bepalen om normale cel-matrixinteracties in cellen in abnormale micro-omgevingen te herstellen20, zoals tumoren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Ontdooien en aliquot laminine-111
OPMERKING: Gezuiverd laminine-111 is in de handel verkrijgbaar (meestal gezuiverd uit de EHS-matrix die wordt verkocht als Matrigel), maar niet alle bronnen leveren intact, niet-afgebroken eiwit.
- Bevestig dat Ln1 niet wordt afgebroken door Ln1 te betrekken en uit te voeren met uitsluitingschromatografie26 of polyacrylamidegelelektroforese26. Gedenatureerd Ln1 moet banden hebben van 337 kDa, 197 kDa en 177 kDa, en native Ln1 moet een enkele band van 711 kDa hebben.
- Ontdooi Ln1 een nacht op ijs in de koelkast en aliquot in microcentrifugebuisjes met een laag eiwitgehalte (meestal aliquot bij 100 μg/buis voor kweekoverlays of 10 μg voor coatings) met behulp van eiwitarme bindingstips en steriele techniek27. Vries aliquots in en bewaar bij -80 °C.
2. Lamininepolymerisatie met behulp van lage pH-buffers
- Maak polyLM polymerisatiebuffer: Weeg 1 mM CaCl2 en 20 mM natriumacetaat af en meng het in ultrapuur water. Pas vervolgens de pH aan naar 4,0, met behulp van HCl of azijnzuur. Steriel filteren door 0,2 μm filter, en bewaren bij 4 °C.
- Maak een polymerisatiebuffer onder controle: Meng 1 mM CalCl2 en 20 mM Tris en pas de pH aan op 7,0, indien nodig met 10 N HCl of 12 N NaOH. Steriel filteren door 0,2 μm filter, en bewaren bij 4 °C.
OPMERKING: Protocol kan hier worden gepauzeerd. - Ontdooi het benodigde aantal Ln-1 aliquots een nacht in de koelkast.
- Voeg met behulp van een steriele celkweektechniek de juiste buffer (polyLM-polymerisatiebuffer uit stap 2.1 of controlepolymerisatiebuffer uit stap 2.2) toe aan lamininealiquots in een eindconcentratie van 100 μg/ml (d.w.z. voeg 0,5 ml toe aan aliquots van 50 μg) en meng voorzichtig door te pipetteren.
- Als u fluorescerend gelabeld laminine gebruikt voor visualisatie, reconstitueer en voeg het toe in een verhouding van 1:50 gew./gewicht (bijv. 2 μg/100 μg) en meng voorzichtig door te pipetteren.
OPMERKING: Als u laminines gebruikt als substraat voor celbevestiging, volg dan stap 2.6-2.8: - Breng lamininen onmiddellijk na verdunning in een geschikte buffer over op kweekplastic of glaswerk en incubeer een nacht in een celkweekincubator bij 37 °C. Merk op dat bij het coaten van dekglaasjes een voldoende groot volume moet worden toegevoegd om een evenwichtige druppel te produceren (gebruik meestal 50 μl voor een rond dekglaasje van 13 mm) en een nacht in een bevochtigde kamer bij 37 °C moet worden bewaard.
- Gebruik steriele techniek27 om te wassen met 1x fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS).
- Verwijder de vloeistof voorzichtig. Zorg ervoor dat het oppervlak niet volledig droog is.
OPMERKING: Als u laminines gebruikt om cellen te bedekken voor melkeiwitinductie, volg dan stap 2.9-2.12: - Kweek borstepitheelcellen. Kweek MepG-dystroglycaan-knock-in-cellen (DgKI) of MepG-dystroglycaan-knock-outcellen (DgKO) in DMEM-F12 aangevuld met 2% FBS, 0,01 mg/ml insuline, 0,005 μg/ml EGF, 0,05 mg/ml gentamycine en 0,05 g/ml normocine.
- Zaad DgKO- en DgKI-cellen voor lamininestimulatie bij 10.500 cellen/cm2 in putplaten of dekglaasjes
- Incubeer verdunde laminines in een celkweekincubator bij 37 °C gedurende 30 minuten.
- Centrifugeer polyLM aliquots bij 2.000 x g gedurende 20 minuten, maar centrifugeer LM in neutrale pH bij 20.000 x g gedurende 20 minuten vanwege de kleinere omvang van de eiwitentiteiten en de behoefte aan hogere snelheden om effectief te verzamelen.
- Verwijder het supernatans voorzichtig met behulp van steriele techniek27 en resuspendeer DMEM-F12 in een geschikt volume inductiemedium, aangevuld met 3 μg/ml prolactine, 2,8 μM hydrocortison en 5 μg/ml insuline
- Breng laminine onmiddellijk over in het celkweekmedium om de cellen te stimuleren. We hebben met succes cellen gestimuleerd met 50-800 μg/ml Ln1
3. Lamininepolymerisatie met behulp van geïsoleerde glycoproteïnen
- Ontdooi recombinant nidogen-1 en Ln1 een nacht zachtjes op ijs in de koelkast.
- Meng Ln1 met nidogen-1 in een verhouding van 1:1 gew./gewicht in een celkweekmedium met behulp van eiwitarme bindingstips en -buisjes en met behulp van een steriele techniek. Gebruik pure Ln1 in celkweekmedium als controle.
- Als u fluorescerend gelabeld laminine gebruikt voor visualisatie, reconstitueer en voeg toe in een verhouding van 1:50 gew./gewicht (bijv. 2 μg/100 μg). Meng voorzichtig door te pipetteren.
- Incubeer Ln1-nidogen of controleer Ln1 in een celkweekincubator bij 37 °C gedurende 30 min.
- Centrifugeer Ln1-nidogen-copolymeren bij 2.000 x g gedurende 30 minuten en de controle Ln1 bij 20.000 x g gedurende 30 minuten.
- Verwijder het supernatans voorzichtig en resuspendeer in het celkweekmedium tot een uiteindelijke concentratie van 100-800 μg totaal eiwit/ml.
- Onmiddellijk gebruiken om cellen te stimuleren, of overbrengen naar dekglaasjes en een nacht laten hechten bij 37 °C in bevochtigde celkweekincubatoren.
- Verwijder het kweekmedium van dekglaasjes, was het dekglaasje met 1x PBS en fixeer het vervolgens met 10% formaline (d.w.z. 4% formaldehyde in PBS) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
4. Lamininepolymerisatie met behulp van dystroglycaanexpressiecellen
- Kweek borstepitheelcellen. Kweek MepG-dystroglycaan-knock-in-cellen (DgKI) of MepG-dystroglycaan-knock-outcellen (DgKO) in DMEM-F12 aangevuld met 2% FBS, 0,01 mg/ml insuline, 0,005 μg/ml EGF, 0,05 mg/ml gentamycine en 0,05 g/ml normocine.
- Zaai DgKI-cellen bij 5.000 cellen/cm2 en zaad DgKO-cellen bij 8.000 cellen/cm2 als gevolg van verschillen in groeisnelheid. Kweek bij 37 °C in bevochtigde incubatoren met mediawissels om de 2-3 dagen en passages om de 4-5 dagen met behulp van een rigoureuze steriele techniek. Tel de cellen zorgvuldig met een hemocytometer of geautomatiseerde celteller27 om de juiste groeisnelheid te garanderen.
- Zaadcellen voor lamininestimulatie bij 10.500 cellen/cm2 in putplaten of dekglaasjes en kweek gedurende 2 dagen, waarbij DgKI-cellen worden gebruikt om fractale Ln1- en DgKO-cellen te genereren als negatieve controles. Ontdooi Ln-1 een nacht zachtjes op ijs in de koelkast en meng vervolgens met inductiemedium DMEM-F12 aangevuld met 3 μg/ml prolactine, 2,8 μM hydrocortison en 5 μg/ml insuline. Gebruik voor een schaal van 35 mm 1 ml inductiemedia met 50-800 μg Ln1.
- Als u fluorescerende Ln1 gebruikt, meng dan in een verhouding van 50:1 gew./wt.
- Verwijder media uit de cellen en bedek met laminine en inductiemedia van DMEM-F12 aangevuld met 3 μg/ml prolactine, 2,8 μM hydrocortison en 5 μg/ml insuline
- Kweek cellen gedurende 2 dagen en fixeer ze vervolgens met 10% formaline.
5. Karakterisering van de lamininemicrostructuur via optische microscopie
- Verzamel vaste monsters en was 3 keer met 1x PBS op kamertemperatuur gedurende 5 min.
- Blokkeer en permeabiliseer monsters in 1x PBS met 0,5% Triton X-100, 3% runderserumalbumine, 10% geitenserum en 40 μg/ml antimuisblokkerend antilichaamfragment gedurende 1 uur bij kamertemperatuur in een bevochtigde kamer.
OPMERKING: Triton X-100 is gevaarlijk. Hanteren met handschoenen en oogbescherming en op de juiste manier weggooien. - Meng antilaminine-antilichamen in een verdunning van 1:100 met 1x PBS met 0,5% Triton X-100 en 3% BSA en voeg toe aan monsters gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of 's nachts bij 4 °C in een bevochtigde kamer (gebruik meestal tipboxen met een nat laboratoriumdoekje op de bodem).
- Verwijder het primaire antilichaam en was 3 keer met 1x PBS met 0,5% Triton X-100 en 3% BSA.
- Voeg een geschikt secundair antilichaam in een verdunning van 1:500 toe aan monsters in 1x PBS met 0,5% Triton X-100 en 3% BSA en incubeer bij kamertemperatuur in het donker in een bevochtigde kamer.
- Verwijder secundair antilichaam en was 3 keer met 1x PBS met 0,5% Triton X-100 en 3% BSA.
- Voeg voor monsters die cellen bevatten 6 μM phalloidine toe gedurende 45 minuten, gevolgd door 3 wasbeurten met PBS met 0,5% Triton X-100 en 3% BSA, en gevolgd door 3 wasbeurten met PBS. Kleurs vervolgens gedurende 5 minuten met 0,1 μg/ml DAPI in PBS.
- Monteer monsters indien van toepassing.
- Afbeelding ln-1-structuur met behulp van confocale microscopie met hoge resolutie. Gebruik een laserscanmicroscoop die is uitgerust met onderdompelingsobjectieven (onderdompeling in water Plan Apochromat 40X/1.1NA of olie-onderdompeling Plan Apochromat 63X/1.4NA).
6. Karakterisering van laminineconstructies via de afmeting van het tellen van dozen
- Analyseer op fractale eigenschappen met behulp van dimensiealgoritmen voor het tellen van dozen die beschikbaar zijn in Matlab-toolboxen of in ImageJ. Deze methoden drempelbeelden van laminine en plotten op een log-log plot het aantal dozen met Ln1 in vergelijking met de grootte van de dozen. De helling van de relatie tussen deze parameters is de dimensie van het tellen van dozen: niet-fractale geometrieën hebben een dimensie van 0, 1 of 2, terwijl fractale geometrieën een niet-gehele dimensiehebben 28.
OPMERKING: Met zuur behandelde, met glycoproteïne behandelde en DgKI-celgebonden Ln1 hebben allemaal een fractale dimensie van ~1,7, terwijl controle-Ln1 een fractale dimensie van 2,0 heeft.
7. Karakterisering van laminineconstructen via elektronenmicroscopie
- Resuspendeer laminines in celkweekmedia en laat gedurende 90 minuten adsorberen aan silicawafels in een vochtige omgeving van 37 °C.
- Fixeer matrices in 2,5% glutaaraldehyde in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer bij pH 7,2.
NOTITIE: Glutaaraldehyde is gevaarlijk en moet worden gehanteerd in een zuurkast met handschoenen en oogbescherming en worden weggegooid als gevaarlijk afval. - Postfix-matrices in 1% osmiumtetroxide in 0,1 M natriumcacodylaatbuffer bij pH 7,2.
NOTITIE: Osmiumtetroxide is gevaarlijk en moet in een zuurkast met handschoenen en oogbescherming worden gehanteerd en op de juiste manier worden weggegooid. Cacodylaat is gevaarlijk en moet in een zuurkast met handschoenen en oogbescherming worden gehanteerd en op de juiste manier worden afgevoerd. - Was 3 keer in natriumcacodylaatbuffer bij pH 7,2.
- Dehydrateer met toenemende concentraties ethanol.
- Sputtercoatmatrices met een dun laagje goud.
- Afbeelding met behulp van scanning-elektronenmicroscopie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Laminine-111 is een trimerisch eiwit met drie zelfassemblerende domeinen aan het einde van zijn korte armen (Figuur 1A). Wanneer ze op de juiste manier worden behandeld, kunnen de korte armen polymeriseren tot een zeshoekig rooster (Figuur 1B,1C), dat diffusiebeperkte aggregaatfractale eigenschappen vertoont op grotere ruimtelijke schalen (Figuur 2). Laminine geïncubeerd in calciumhoudende neutrale pH-buffers vormt kleine aggregaten gevisualiseerd met een anti-Ln1-antilichaam (Figuur 2A), die een fractale afmeting van ~2 hebben, wat aangeeft dat er geen fractaliteit is. Daarentegen vormt Ln1 geïncubeerd in calciumbevattende pH4-buffer (Figuur 2B), of in neutrale buffer met nidogen-1 (Figuur 2C) ruimtevullende lacynetwerken met een fractale dimensie van ~1,7 (Figuur 3). Ln1 gekweekt met dystroglycaanexpressiecellen vormt vergelijkbare lacy-netwerken (Figuur 2D, inzet toont celkernen).
Wanneer pH7Ln en polyLM worden afgebeeld met SEM met toenemende resolutie, worden de verschillen in microstructuur duidelijker. Bij lage resolutie (Figuur 2Ei en v) lijken polyLM-netwerken meer verspreid in vergelijking met pH7-Ln, en bij hoge resolutie zijn pH7-Lon-aggregaten zichtbaar (Figuur 2E iv), terwijl een gespreid zeshoekig rooster te zien is in polyLM bij hoge resolutie (Figuur 2E viii).
Figuur 1: Achtergrond van Ln1 en polymerisatiemethode: A: Ln1 is een complex trimerisch eiwit met meerdere adhesieve domeinen (receptorbindingsplaatsen genoteerd), dat een verscheidenheid aan integrine- en niet-integrinereceptoren (in zwart) kan binden en polymere netwerken kan vormen door korte arm-korte armbinding (in tan). B: Ln1 kan een zeshoekig rooster vormen in aanwezigheid van calciumionen en ofwel lage pH, glycoproteïnen zoals nidogen-1 of dystroglycaan op het celoppervlak. C: voorbeeld SEM-afbeelding van gepolymeriseerd Ln1 met zeshoekig rooster en voorgesteld Ln1-assemblagemodel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve gegevens voor Ln1-polymerisatie. A: Ln1 aggregeert in neutrale buffers met calcium. Wanneer gevisualiseerd met een anti-Ln1-antilichaam, kunnen kleine aggregaten worden gezien. B: Ln1 in zure calciumhoudende buffer polymeriseert tot polyLM, dat fractale eigenschappen vertoont. C: Ln1-nidogen-1-mengsel (1:1 gew./gew./gew.) vormt vergelijkbare polymeren. D: Ln1 in neutraal gebufferde celkweekmedia bedekt met dystroglycaanexpressiecellen vertoont een vergelijkbaar lacy netwerk. Inzet: nucleaire tegenkleuring met celmorfologie. E: Scanning elektronenmicroscopie van pH7-Ln en polyLM netwerken (spin down methode) met toenemende resolutie. In pH7-Ln tonen scans met een lage resolutie (i en ii) relatief compacte vezels, die oplossen als aggregaten in scans met een hoge resolutie (iii). polyLM bij dezelfde concentratie is veel meer verspreid (iv&v), en scans met hoge resolutie tonen een zeshoekig, ruimtevullend rooster (vii). F: Deze microstructurele verandering zorgt ervoor dat DgKO-epitheelcellen van de borstklier functioneel differentiëren tot melkproducerende cellen19. i: pH7-Ln gestimuleerde cellen vertonen overvloedige actine-stressvezels (rood) en ongeorganiseerde zo-1 met tight junctions (groen), terwijl ii: polyLM-gestimuleerde cellen minder totale filamenteuze actine bevatten, laterale lokalisatie van actine in de cel-celgrens en goed georganiseerde zo-1 met tight junctions. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schatting van de fractale dimensie met de methode voor het tellen van dozen. A&B: Raw-beeld van pH7-Ln en polyLM toont verschillen in morfologie. C&D: deze beelden worden gedrempeld om een zwart-wit beeld te krijgen, E&F: dan wordt het logboek berekend van de verhouding tussen het aantal vakjes met het beeld en de grootte van het vakje. De gemiddelde helling vertegenwoordigt de doosteldimensie Fd wordt berekend. pH7-Ln heeft een karakteristieke dimensie van 2,0, wat aangeeft dat er geen fractale eigenschappen zijn, terwijl polyLM een dimensie heeft van ~1,7, wat wijst op een diffusiebeperkt aggregatieproces. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Laminines vertegenwoordigen een sleutelelement van de ECM in epitheel-, spier- en neurale orgaansystemen, en in vitro is aangetoond dat ze een essentiële rol spelen bij het reguleren van de functionele differentiatie van cellen. Er zijn steeds meer aanwijzingen dat de structuur van laminine die aan cellen wordt getoond, de signalering en het resulterende celfenotype15,16 reguleert, dus methoden om de Ln1-microstructuur te beheersen zouden van belang moeten zijn voor basisbiologen die op deze gebieden werken, en voor weefselingenieurs die normaal gedrag in vitro willen recapituleren. Meer in het algemeen is bekend dat de microstructuur van een verscheidenheid aan extracellulaire matrixeiwitten de biologische respons reguleert en het begrijpen van de mechanismen waarmee microstructuur de celfunctie moduleert, is een actief onderzoeksgebied.
In dit werk beschrijven we drie methoden om laminine te polymeriseren in netwerken met een fractale microstructuur die kenmerkend is voor diffusiebeperkte aggregatie. Van deze Ln1-polymeren is aangetoond dat ze anders signaleren naar cellen in vergelijking met geaggregeerd Ln1, mogelijk als gevolg van een veranderde weergave van het kleefdomein aan cellen. Deze drie methoden om de Ln1-microstructuur te beheersen, kunnen biologische redundantie vertegenwoordigen bij de assemblage van Ln1, maar dit vormt een uitdaging voor experimenteel werk. Het beheersen van de Ln1-microstructuur met behulp van zure bufferbehandeling zal alleen effecten vertonen wanneer het wordt toegevoegd aan dystroglycaan-knock-outcellen19,20. Bij het experimentele ontwerp moet dus rekening worden gehouden met de cellen en de zuiverheid van Ln1 die moeten worden gebruikt. In de handel verkrijgbaar Ln1 is gewoonlijk afgeleid van de EHS-matrix, die een hoog percentage nidogenen en andere glycoproteïnen bevat; Ln1 in de EHS-matrix polymeriseert correct in fractale netwerken in neutrale gebufferde systemen. Recombinant Ln1 is sinds kort in de handel verkrijgbaar, maar is uitzonderlijk duur.
De kwaliteit van het Ln1-eiwit is cruciaal voor dit werk, omdat fragmenten van de korte arm de polymerisatie kunnen blokkeren. Korte armfragmenten (d.w.z. het E4-fragment) interfereren met de vorming van netwerken omdat elk fragment een leegte in het netwerk veroorzaakt29. Eerdere gegevens tonen aan dat opname van E4-fragmenten Ln1-geïnduceerde fenotypes kan blokkeren29,30. Evenzo hebben we ontdekt dat netwerkvorming wordt verstoord door kleine hoeveelheden laminine-332 (niet-gepubliceerde gegevens), dat net als E4-fragmenten een enkel kleefstofdomein bevat29,30. Het is dus van cruciaal belang om te controleren of Ln1 intact is en sterk gezuiverd om andere lamininesoorten te verwijderen voordat u met het werk begint.
Hoewel deze methoden relevant zijn voor onderzoekers die cel-matrixinteracties bestuderen, moet worden opgemerkt dat de lamininefamilie zeer complex is, met 15 bekende leden en extra splice-varianten31, en deze familie interageert met een breed scala aan receptoren, glycoproteïnen, collagenen en mogelijk groeifactoren4. Gepolymeriseerd Ln1 vertegenwoordigt dus een reductionistische toestand waarvan kan worden verwacht dat deze snel wordt gewijzigd door de celfunctie. Bovendien detecteren, reageren en hermodelleren verschillende orgaansystemen laminines anders: we hebben aangetoond dat de koppeling van laminine aan actine via dystroglycaan overbodig is voor de borstklier19, terwijl dystroglycaan absoluut noodzakelijk is voor de functie van de myocyten32.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dit werk werd uitgevoerd onder auspiciën van het Amerikaanse ministerie van Energie door Lawrence Livermore National Laboratory onder contract DE-AC52-07NA27344. IM-versie LLNL-JRNL-799443.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door Lawrence Livermore National Lab LDRD 18-ERD-062 (aan C.R.). Met dank aan John Muschler voor zijn vriendelijke gift van de DgKO- en DgKI-cellen. Dank aan het personeel van het Berkeley Electron Microscope Laboratory van de Universiteit van Californië voor advies en hulp bij de voorbereiding van elektronenmicroscopiemonsters en het verzamelen van gegevens.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% formalin | Sigma Aldrich | HT501128 | |
| Anti-Laminin primary antibody | Sigma Aldrich | L9393 | |
| Anti-Rabbit Alexafluor 488 secondary antibody | Thermo | A32731 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 or similar | |
| Cell Culture Incubator | Thermo | Heracell 150 or similar | |
| Centrifuge for microcentrifuge tubes | Eppendorf | 5418 or similar | |
| Confocal Microscope | Zeiss | LSM 710 or equivalent | |
| Coverslips | Thermo | 25CIR-1 or similar | |
| DMEM-F12, Liquid, High Glucose, +HEPES, L-glutamine, +Phenol red | Thermo | 11330107 | |
| EGF (Epidermal Growth Factor) | Sigma Aldrich | 11376454001 | |
| Fluorescently Labeled Laminin | Cytoskeleton Inc | LMN02 | |
| Gentamicin | VWR | VWRV0304-10G | |
| Glutaraldehyde | Sigma Aldrich | G5882 | |
| HCl | Sigma Aldrich | 320331 or similar | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888-5G | |
| Insulin | Sigma Aldrich | 16634-50mg | |
| MepG Dystroglycan Knockout Cells | LBNL | N/A | |
| NaOH | Sigma Aldrich | S8045 or similar | |
| Normocin | Invivogen | ant-nr-1 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma Aldrich | 75633 | |
| Ovine Prolactin | Los Angeles Biomedical Research Institute | Ovine Pituitary Prolactin | |
| Phalloidin | Thermo | A22287 | |
| Phosphate Buffered Saline | Thermo | 10010023 or similar | |
| Purified Laminin-111 | Sigma Aldrich | L2020-1MG | |
| Recombinant human Nidogen-1, carrier free | R&D systems | 2570-ND-050 | |
| Sodium Acetate | Sigma Aldrich | S2889 or similar | |
| Sodium Cacodylate | Sigma Aldrich | C0250 | |
| Sterile filters | Millipore | SLGP033RS or similar | |
| Tris | Sigma Aldrich | 252859 or similar | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Ultra-low protein binding tubes | VWR | 76322-516, 76322-522 or similar | |
| Ultrapure water | Thermo | 15230253 or similar |
References
- Carey, S. P., Kraning-Rush, C. M., Williams, R. M., Reinhart-King, C. A. Biophysical control of invasive tumor cell behavior by extracellular matrix microarchitecture. Biomaterials. 33 (16), 4157-4165 (2012).
- Wang, K., et al. Stiffening and unfolding of early deposited-fibronectin increase proangiogenic factor secretion by breast cancer-associated stromal cells. Biomaterials. 54, 63-71 (2015).
- Bruekers, S. M. C., et al. Fibrin-fiber architecture influences cell spreading and differentiation. Cell Adhesion & Migration. 10 (5), 495-504 (2016).
- Yurchenco, P. D. Integrating Activities of Laminins that Drive Basement Membrane Assembly and Function. Curr Top Membr. 76, 1-30 (2015).
- Colognato, H., Winkelmann, D. A., Yurchenco, P. D. Laminin Polymerization Induces a Receptor-Cytoskeleton Network. The Journal of Cell Biology. 145 (3), 619-631 (1999).
- Powell, S. K., Kleinman, H. K. Neuronal laminins and their cellular receptors. International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 29 (3), 401-414 (1997).
- Li, M. L., et al. Influence of a reconstituted basement membrane and its components on casein gene expression and secretion in mouse mammary epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (1), 136-140 (1987).
- Fiore, A., et al. Laminin-111 and the Level of Nuclear Actin Regulate Epithelial Quiescence via Exportin-6. Cell Rep. 19 (10), 2102-2115 (2017).
- Inman, J. L., Robertson, C., Mott, J. D., Bissell, M. J. Mammary gland development: cell fate specification, stem cells and the microenvironment. Development. 142 (6), 1028-1042 (2015).
- Weaver, V. M., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. Journal of Cell Biology. 137 (1), 231-245 (1997).
- Furuta, S., Ren, G., Mao, J. -H., Bissell, M. J. Laminin signals initiate the reciprocal loop that informs breast-specific gene expression and homeostasis by activating NO, p53 and microRNAs. eLife. 7, 26148 (2018).
- Brown, S. C., et al. Dystrophic phenotype induced in vitro by antibody blockade of muscle alpha-dystroglycan-laminin interaction. Journal of Cell Science. 112 (2), 209 (1999).
- Calof, A. L., Campanero, M. R., O'Rear, J. J., Yurchenco, P. D., Landert, A. D. Domain-specific activation of neuronal migration and neurite outgrowth-promoting activities of laminin. Neuron. 13 (1), 117-130 (1994).
- Li, S., et al. Laminin-sulfatide binding initiates basement membrane assembly and enables receptor signaling in Schwann cells and fibroblasts. The Journal of Cell Biology. 169 (1), 179-189 (2005).
- Sonnenberg, A., et al. Integrin recognition of different cell-binding fragments of laminin (P1, E3, E8) and evidence that alpha 6 beta 1 but not alpha 6 beta 4 functions as a major receptor for fragment E8. The Journal of Cell Biology. 110 (6), 2145-2155 (1990).
- Sorokin, L., Sonnenberg, A., Aumailley, M., Timpl, R., Ekblom, P. Recognition of the laminin E8 cell-binding site by an integrin possessing the alpha 6 subunit is essential for epithelial polarization in developing kidney tubules. The Journal of Cell Biology. 111 (3), 1265-1273 (1990).
- Horejs, C. -M., et al. Biologically-active laminin-111 fragment that modulates the epithelial-to-mesenchymal transition in embryonic stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (16), 5908-5913 (2014).
- Hochman-Mendez, C., Cantini, M., Moratal, D., Salmeron-Sanchez, M., Coelho-Sampaio, T. A Fractal Nature for Polymerized Laminin. PLOS ONE. 9 (10), 109388 (2014).
- Kent, A. J., et al. The microstructure of laminin-111 compensates for dystroglycan loss in mammary epithelial cells in downstream expression of milk proteins. Biomaterials. 218, 119337 (2019).
- Weir, M. L., et al. Dystroglycan loss disrupts polarity and beta-casein induction in mammary epithelial cells by perturbing laminin anchoring. Journal of Cell Science. 119, Pt 19 4047-4058 (2006).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Palmero, C. Y., et al. The follicular thyroid cell line PCCL3 responds differently to laminin and to polylaminin, a polymer of laminin assembled in acidic pH. Molecular and Cellular Endocrinology. 376 (1), 12-22 (2013).
- Hochman-Mendez, C., Lacerda de Menezes, J. R., Sholl-Franco, A., Coelho-Sampaio, T.
- Leal-Lopes, C., Grazioli, G., Mares-Guia, T. R., Coelho-Sampaio, T., Sogayar, M. C. Polymerized laminin incorporation into alginate-based microcapsules reduces pericapsular overgrowth and inflammation. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 13 (10), 1912-1922 (2019).
- Paccola Mesquita, F. C., Hochman-Mendez, C., Morrissey, J., Sampaio, L. C., Taylor, D. A. Laminin as a Potent Substrate for Large-Scale Expansion of Human Induced Pluripotent Stem Cells in a Closed Cell Expansion System. Stem Cells International. 2019, 9 (2019).
- Walker, J. M. The Protein Protocols Handbook. Walker, J. M. , Humana Press. 61-67 (2002).
- Freshney, R. I. Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques. 7th edition. , John Wiley and Sons. (2016).
- Mandelbrot, B. The Fractal Geometry of Nature. , WH Freedman and Company. (1982).
- Schittny, J. C., Yurchenco, P. D. Terminal short arm domains of basement membrane laminin are critical for its self-assembly. Journal of Cell Biology. 110 (3), 825-832 (1990).
- Schuger, L., Yurchenco, P., Relan, N. K., Yang, Y. Laminin fragment E4 inhibition studies: basement membrane assembly and embryonic lung epithelial cell polarization requires laminin polymerization. International Journal of Developmental Biology. 42 (2), 217-220 (1998).
- Colognato, H., Yurchenco, P. D. Form and function: the laminin family of heterotrimers. Developmental Dynamics. 218 (2), 213-234 (2000).
- Kabaeva, Z., Meekhof, K. E., Michele, D. E. Sarcolemma instability during mechanical activity in Large myd cardiac myocytes with loss of dystroglycan extracellular matrix receptor function. Human Molecular Genetics. 20 (17), 3346-3355 (2011).
