عزل القلب البطيني البشري من شرائح عضلة القلب المقطّع بالهزاز
Summary
قدم هو بروتوكول لعزل القلب البطيني البشري والحيواني من شرائح عضلة القلب قطع هزاز. يمكن الحصول على غلة عالية من الخلايا المتحملة للكالسيوم (تصل إلى 200 خلية/ملغ) من كميات صغيرة من الأنسجة (<50 ملغ). البروتوكول ينطبق على عضلة القلب المعرضة لاقفوية البرد لمدة تصل إلى 36 ساعة.
Abstract
إن عزل الخلايا العضلية القلبية البطينية عن قلوب الحيوانات والبشر هو طريقة أساسية في أبحاث القلب. عادة ما يتم عزل الخلايا القلبية الحيوانية عن طريق التسريب التاجي مع الإنزيمات الهضمية. ومع ذلك، فإن عزل عضلة القلب البشرية يشكل تحدياً لأن عينات عضلة القلب البشرية عادة لا تسمح بالانكسار التاجي، وتؤدي بروتوكولات العزل البديلة إلى نقص الغلة للخلايا القابلة للحياة. بالإضافة إلى ذلك، فإن عينات عضلة القلب البشرية نادرة ولا تتوفر إلا بانتظام في المؤسسات التي جراحية في القلب في الموقع. وهذا يعوق ترجمة النتائج من الحيوانات إلى أمراض القلب البشرية. هو موضح هنا بروتوكول موثوق به التي تمكن من عزل فعالة من myocytes البطينية من عضلة القلب الحيوانية والبشرية. لزيادة نسبة السطح إلى الحجم مع تقليل تلف الخلايا، يتم توليد شرائح أنسجة عضلة القلب 300 ميكرومتر سميكة من عينات عضلة القلب مع هزاز. ثم يتم هضم شرائح الأنسجة مع البروتياز والكولاجيناز. تم استخدام عضلة القلب الجرذ لإنشاء البروتوكول وقياس غلة الخلايا myocytes القابلة للحياة والمتحملة للكالسيوم عن طريق عد الخلايا الخلوية المتدفقة. وأظهرت المقارنة مع طريقة قطعة الأنسجة المستخدمة بشكل شائع عوائد أعلى بكثير من خلايا القلب على شكل قضيب (41.5 ± 11.9 مقابل 7.89 ± 3.6٪، p < 0.05). وقد تُرجم البروتوكول إلى عضلة القلب البشرية الفاشلة وغير الفاشلة، حيث كانت الغلة مماثلة كما في عضلة القلب الجرذ، ومرة أخرى، أعلى بشكل ملحوظ مما كانت عليه مع طريقة قطعة الأنسجة (45.0 ± 15.0 مقابل 6.87 ± 5.23 خلية/ملغم، p < 0.05). وتجدر الإشارة إلى أنه مع تقديم البروتوكول من الممكن عزل أعداد معقولة من خلايا القلب القلبية البشرية القابلة للحياة (9-200 خلية/ملغ) من كميات دنيا من الأنسجة (<50 ملغ). وبالتالي، فإن الطريقة تنطبق على عضلة القلب صحية وفشل من قلوب الإنسان والحيوان على حد سواء. وعلاوة على ذلك، فمن الممكن لعزل myocytes مثير وانكماشية من عينات الأنسجة البشرية المخزنة لمدة تصل إلى 36 ح في حل القلب النابل البارد، مما يجعل الأسلوب مفيدا بشكل خاص للمختبرات في المؤسسات دون جراحة القلب في الموقع.
Introduction
تقنية المنوية التي مهدت الطريق إلى رؤى هامة في علم وظائف الأعضاء cardiomyocyte هو عزل القلب البطيني الحية من قلوب سليمة1. يمكن استخدام خلايا القلب المعزولة لدراسة الهيكل الخلوي الطبيعي والوظيفة ، أو عواقب التجارب الحية. على سبيل المثال، لتقييم التغيرات في الفيزيولوجيا الكهربائية الخلوية أو اقتران الإثارة والانكماش في النماذج الحيوانية لمرض القلب. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام خلايا القلب المعزولة لثقافة الخلايا، والتدخلات الدوائية، ونقل الجينات، وهندسة الأنسجة، والعديد من التطبيقات الأخرى. ولذلك، أساليب فعالة لعزل القلب و القلب هي ذات قيمة أساسية للبحوث القلب الأساسية والترجمة.
عادة ما يتم عزل الخلايا القلبية من الثدييات الصغيرة ، مثل القوارض ، ومن الثدييات الكبيرة ، مثل الخنازير أو الكلاب ، عن طريق ضخ القلب التاجي مع حلول تحتوي على الكولاجين الخام و / أو البروتياز. وقد وصفت هذه الطريقة بأنها “معيار الذهب” لعزل القلب والخلايا العضلية، مما أدى إلى غلة تصل إلى 70٪ من الخلايا القابلة للحياة2. وقد استخدمت أيضا النهج مع قلوب الإنسان، مما أدى إلى نتائج القلب وكوسومييت مقبولة3،4،5. ومع ذلك، لأن الضخ التاجي هو ممكن فقط إذا كان القلب سليمة أو إسفين كبير عضلة القلب التي تحتوي على فرع الشريان التاجي هو متاح، معظم العينات القلبية البشرية ليست مناسبة لهذا النهج نظرا لصغر حجمها وعدم وجود الأوعية الدموية المناسبة. ولذلك ، فإن عزل القلب البشري هو التحدي.
عينات عضلة القلب الإنسان تتكون في الغالب من قطع الأنسجة ذات الحجم المتغير (حوالي 0.5 × 0.5 × 0.5 سم إلى 2 × 2 × 2 سم) ، تم الحصول عليها من خلال الخزعات الرحمية6، استئصالات الحاجز7، زرع VAD8، أو من قلوب explanted9. تبدأ الإجراءات الأكثر شيوعًا لعزل القلب والأنسجة باستخدام المقص أو المشرط. ثم يتم تعطيل الاتصالات من خلية إلى خلية عن طريق الانغماس في مخازن خالية من الكالسيوم أو منخفضة الكالسيوم. ويتبع ذلك خطوات الهضم المتعددة مع مستخلصات الإنزيم الخام أو الإنزيمات المنقية مثل البروتياز (مثل التربسين) والكولاجيناز والهيلورونيداز أو الإلستاز مما يؤدي إلى تفكك المصفوفة خارج الخلية وتحرير خلايا القلب. في الخطوة النهائية، الحرجة، تركيز الكالسيوم الفسيولوجية يجب أن يتم استعادتها بعناية، أو يمكن أن يحدث تلف الخلوية بسبب الكالسيوم مفارقة10،11،12. وهذا النهج العزلي ملائم ولكنه غير فعال عادة. على سبيل المثال، وجدت إحدى الدراسات أن ما يقرب من 1 غرام من أنسجة عضلة القلب كان مطلوبا للحصول على عدد كاف من خلايا القلب المناسبة للتجارب اللاحقة13. أحد الأسباب المحتملة لانخفاض الغلة هو طريقة قاسية نسبيا من مفروم الأنسجة. وهذا قد يضر بشكل خاص cardiomyocytes الموجودة على حواف قطعة على الرغم من أن هذه myocytes هي الأكثر احتمالا أن يطلق سراحه عن طريق الهضم الأنزيمي.
جانب آخر قد يؤثر على كفاءة العزل وجودة الخلايا التي تم الحصول عليها من عينات الإنسان هو مدة نقص التروية الأنسجة. تذكر معظم البروتوكولات أوقات النقل القصيرة إلى المختبر كشرط مسبق لتحقيق نتائج جيدة. هذا يحد من دراسة القلب البطينية البشرية إلى المختبرات مع مرافق جراحة القلب القريبة. معا، هذه القيود تعوق التحقق من النتائج الهامة من النماذج الحيوانية في أمراض القلب البشرية. بروتوكولات العزل المحسنة التي تسمح لعوائد القلب و القلب عالية من كميات صغيرة من الأنسجة، ويفضل دون أضرار جسيمة بعد تمديد أوقات النقل، ولذلك من المرغوب فيه.
وصف هنا هو بروتوكول العزل على أساس الهضم الأنزيمي من شرائح رقيقة الأنسجة عضلة القلب ولدت مع هزاز14،15. نثبت أن العزلة عن شرائح الأنسجة أكثر كفاءة بكثير من تلك التي من قطع الأنسجة المفروم مع مقص. الطريقة الموصوفة لا يسمح فقط لغلة عالية من القلب البشري قابلة للحياة من كميات صغيرة من أنسجة عضلة القلب ولكن ينطبق أيضا على العينات المخزنة أو المنقولة في محلول القلب النابل البارد لمدة تصل إلى 36 ساعة.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن عزل أمراض القلب الحية تأسست منذ أكثر من 40 عاما، ولا يزال شرطا مسبقا للعديد من النهج التجريبية في أبحاث القلب، فإنه لا يزال تقنية صعبة مع نتائج لا يمكن التنبؤ بها. يتم استخدام عزل Cardiomyocyte عن طريق ضخ الشرايين التاجية مع محلول الإنزيم عادة لقلوب الحيوانات الصغيرة ويسفر عن أعداد…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر أندرياس ديندورفر من مركز والتر بريندل للطب التجريبي، LMU ميونيخ، للمساعدة في بروتوكول تشريح. لتوفير عينات الأنسجة عضلة القلب البشرية نود أن نشكر الغزالي ميناباري وكريستيان هايم من قسم جراحة القلب، مستشفى جامعة إرلانجن، هندريك ميلتينج من معهد إريك وحنا كلسمان، جامعة روهر بوخوم ومهند الكسار من قسم أمراض القلب لدى الأطفال، مستشفى إرلانجن الجامعي. للحصول على الدعم مع تدفق cytometry نود أن نشكر سيمون فولكل وزملاؤه من مركز البحوث الترجمة (TRC)، مستشفى جامعة إرلانجن. ونود أيضا أن نشكر لورينز ماكارغو وسيلين غرونينغر من معهد علم وظائف الأعضاء الخلوية والجزيئية إرلانجن على الدعم الفني الممتاز.
وقد دعم هذا العمل المركز الألماني لأبحاث القلب والأوعية الدموية، والمركز متعدد التخصصات للبحوث السريرية (IZKF) في المستشفى الجامعي في جامعة إرلانغن نورنبرغ، وجامعة إرلانغن نورنبرغ.
Materials
| Chemicals | |||
| 2,3-butanedionemonoxime | Carl Roth | 3494.1 | Purity>99% |
| Bovine serum albumin | Carl Roth | 163.2 | |
| CaCl2 | Carl Roth | 5239.2 | |
| Creatine monohydrate | Alfa Aesar | B250009 | |
| Glucose | Merck | 50-99-7 | |
| HEPES | Carl Roth | 9105.3 | |
| KCl | Carl Roth | P017.1 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.2 | |
| L-glutamic acid | Fluka Biochemica | 49450 | |
| Low melting-point agarose | Carl Roth | 6351.5 | |
| MgCl2 x 6H2O | Carl Roth | A537.1 | |
| MgSO4 | Sigma Aldrich | M-7506 | |
| NaCl | Carl Roth | 9265.1 | |
| NaHCO3 | Carl Roth | 8551.2 | |
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Taurine | Sigma Aldrich | T8691 | |
| Dyes | |||
| Di-8-ANEPPS | Thermo Fisher Scientific | D3167 | |
| Fluo-4 AM | Thermo Fisher Scientific | F14201 | |
| FluoVolt | Thermo Fisher Scientific | F10488 | |
| Enzymes | |||
| Collagenase CLS type I | Worthington | LS004196 | Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg) |
| Collagenase CLS type II | Worthington | LS004176 | Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg) |
| Protease XIV | Sigma Aldrich | P8038 | Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg) |
| Proteinase XXIV | Sigma Aldrich | P5147 | Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg) |
| Material | |||
| Cell analyzer (LSR Fortessa) | BD Bioscience | 649225 | |
| Centrifuge tube, 15 mL | Corning | 430790 | |
| Centrifuge tube, 50 mL | Corning | 430829 | |
| Compact shaker | Edmund Bühler | KS-15 B control | Agitation direction: horizontal |
| Disposable plastic pasteur-pipettes | Carl Roth | EA65.1 | For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm |
| Forceps | FST | 11271-30 | |
| Heatblock | VWR | BARN88880030 | |
| Nylon net filter, 180 µm | Merck | NY8H04700 | |
| TC Dish 100, Standard | Sarstedt | 83.3902 | |
| TC Dish 35, Standard | Sarstedt | 83.3900 | |
| TC Dish 60, Standard | Sarstedt | 83.3901 | |
| Vibratome (VT1200S) | Leica | 1491200S001 | Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection |
References
- Powell, T., Twist, V. W. A rapid technique for the isolation and purification of adult cardiac muscle cells having respiratory control and a tolerance to calcium. Biochemical and Biophysical Research Communications. 13, 258-283 (1976).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 288-298 (2011).
- Isenberg, G., Klockner, U. Calcium Tolerant Ventricular Myocytes Prepared by preincubation in a KB Medium. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 395, 6-18 (1982).
- Beuckelmann, D. J., Näbauer, M., Erdmann, E. Intracellular calcium handling in isolated ventricular myocytes from patients with terminal heart failure. Circulation. 85, 1046-1055 (1992).
- Brixius, K., Hoischen, S., Reuter, H., Lasek, K., Schwinger, R. H. G. Force/shortening-frequency relationship in multicellular muscle strips and single cardiomyocytes of human failing and nonfailing hearts. Journal of Cardiac Failure. 7, 335-341 (2001).
- Peeters, G. A., et al. Method for isolation of human ventricular myocytes from single endocardial and epicardial biopsies. The American Journal of Physiology. 268, 1757-1764 (1995).
- Coppini, R., et al. Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples. Journal of Visualized Experiments. (86), e51116 (2014).
- Seidel, T., et al. Sheet-Like Remodeling of the Transverse Tubular System in Human Heart Failure Impairs Excitation-Contraction Coupling and Functional Recovery by Mechanical Unloading. Circulation. 135, 1632-1645 (2017).
- Hartmann, N., et al. Antiarrhythmic effects of dantrolene in human diseased cardiomyocytes. Heart Rhythm. 14, 412-419 (2017).
- Bkaily, G., Sperelakis, N., Doane, J. A new method for preparation of isolated single adult myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 247, 1018-1026 (1984).
- Trube, G., Sakmann, B., Neher, E. Enzymatic Dispersion of Heart and Other Tissues. Single-Channel Recording. , 69-76 (1983).
- Schlüter, K. D., Schreiber, D. Adult Ventricular Cardiomyocytes. Basic Cell Culture Protocols. 290, 305-314 (2004).
- Del Monte, F., et al. Restoration of contractile function in isolated cardiomyocytes from failing human hearts by gene transfer of SERCA2a. Circulation. 100, 2308-2311 (1999).
- Brandenburger, M., et al. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovascular Research. 93, 50-59 (2012).
- Fischer, C., et al. Long-term functional and structural preservation of precision-cut human myocardium under continuous electromechanical stimulation in vitro. Nature Communications. 10, (2019).
- Seidel, T., et al. Glucocorticoids preserve the t-tubular system in ventricular cardiomyocytes by upregulation of autophagic flux. Basic Research in Cardiology. 114 (6), 47 (2019).
- Lipsett, D. B., et al. Cardiomyocyte substructure reverts to an immature phenotype during heart failure. Journal of Physiology. 597, 1833-1853 (2019).
- Watson, S. A., et al. Preparation of viable adult ventricular myocardial slices from large and small mammals. Nature Protocols. 12, 2623-2639 (2017).
- Guo, G. R., et al. A modified method for isolation of human cardiomyocytes to model cardiac diseases. Journal of Translational Medicine. 16, 1-9 (2018).
- Kang, C., et al. Human Organotypic Cultured Cardiac Slices: New Platform For High Throughput Preclinical Human Trials. Scientific Reports. 6, 1-13 (2016).
- Gomez, L. A., Alekseev, A. E., Aleksandrova, L. A., Brady, P. A., Terzic, A. Use of the MTT assay in adult ventricular cardiomyocytes to assess viability: Effects of adenosine and potassium on cellular survival. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 29, 1255-1266 (1997).
- Zimmerman, A. N. E., Hülsmann, W. C. Paradoxical influence of calcium ions on the permeability of the cell membranes of the isolated rat heart. Nature. 211, 646-647 (1966).
- Piper, H. M. The calcium paradox revisited An artefact of great heuristic value. Cardiovascular Research. 45, 123-127 (2000).
- Boink, A. B. T. J., Ruigrok, T. J. C., de Moes, D., Maas, A. H. J., Zimmerman, A. N. E. The effect of hypothermia on the occurrence of the calcium paradox. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 385, 105-109 (1980).
- Mulieri, L. A., Hasenfuss, G., Ittleman, F., Blanchard, E. M., Alpert, N. R. Protection of human left ventricular myocardium from cutting injury with 2,3-butanedione monoxime. Circulation Research. 65, 1441-1444 (1989).
- Busselen, P. Effects of sodium on the calcium paradox in rat hearts. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 408, 458-464 (1987).
- Voigt, N., Zhou, X. B., Dobrev, D. Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+Transients and Membrane Currents. Journal of Visualized Experiments. (77), e50235 (2013).
- Leor, J., Kloner, R. An Experimental Model Examining the Role of Magnesium in the Therapy of Acute Myocardial Infarction. The American Journal of Cardiology. 75, 1292-1293 (1995).
- Herzog, W. R., et al. Timing of Magnesium Therapy Affects Experimental Infarct Size. Circulation. 92, 2622-2626 (1995).
- Stringham, J. C., Paulsen, K. L., Southard, J. H., Mentzer, R. M., Belzer, F. O. Forty-hour preservation of the rabbit heart: Optimal osmolarity, [Mg2+], and pH of a modified UW solution. The Annals of Thoracic Surgery. 58, 7-13 (1994).
- Hall, S. K., Fry, C. H. Magnesium affects excitation, conduction, and contraction of isolated mammalian cardiac muscle. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 263 (2), 622-633 (1992).
- Bussek, A., et al. Tissue Slices from Adult Mammalian Hearts as a Model for Pharmacological Drug Testing. Cellular Physiology and Biochemistry. 24, (2009).
- Wang, K., et al. Living cardiac tissue slices: An organotypic pseudo two-dimensional model for cardiac biophysics research. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 115, 314-327 (2014).
- Thomas, R. C., et al. A Myocardial Slice Culture Model Reveals Alpha-1A-Adrenergic Receptor Signaling in the Human Heart. Journal of the American College of Cardiology: Basic to Translational Science. 1, 155-167 (2016).
- Perreault, C. L., et al. Cellular basis of negative inotropic effect of 2,3-butanedione monoxime in human myocardium. American Journal of Physiology – Heart and Circulatory Physiology. 263, 503-510 (1992).
- Vahl, C. F., Bonz, A., Hagl, C., Hagl, S. Reversible desensitization of the myocardial contractile apparatus forcalcium: A new concept for improving tolerance to cold ischemia in human myocardium. European Journal of Cardio-thoracic Surgery. 8, 370-378 (1994).
- Horiuti, K., et al. Mechanism of action of 2, 3-butanedione 2-monoxime on contraction of frog skeletal muscle fibres. Journal of Muscle Research and Cell Motility. 9, 156-164 (1988).
- Li, T., Sperelakis, N., Teneick, R. E., Solaro, R. J. Effects of diacetyl monoxime on cardiac excitation-contraction coupling. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 232, 688-695 (1985).
- Sellin, L. C., Mcardle, J. J. Multiple Effects of 2,3 Butanedione Monoxime. Pharmacology and Toxicology. 74, 305-313 (1993).
- Eghbali-Webb, M., Agocha, A. E., Pierce, G. N., Claycomb, W. C. A simple method for preparation of cultured cardiac fibroblasts from adult human ventricular tissue. Novel Methods in Molecular and Cellular Biochemistry of Muscle. , 195-198 (1997).
- Camelliti, P., et al. Adult human heart slices are a multicellular system suitable for electrophysiological and pharmacological studies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51, 390-398 (2011).
- Watson, S. A., et al. Biomimetic electromechanical stimulation to maintain adult myocardial slices in vitro. Nature Communications. 10, 2168 (2019).
- Watson, S. A., Terracciano, C. M., Perbellini, F. Myocardial Slices: an Intermediate Complexity Platform for Translational Cardiovascular Research. Cardiovascular Drugs and Therapy. 33, 239-244 (2019).
