Isolement des cardiomyocytes ventriculaires humains des tranches myocardales vibratoires-cut

Summary

Présenté est un protocole pour l’isolement des cardiomyocytes ventriculaires humains et animaux des tranches myocardales vibratoires. Des rendements élevés de cellules tolérantes au calcium (jusqu’à 200 cellules/mg) peuvent être obtenus à partir de petites quantités de tissus (<50 mg). Le protocole s’applique au myocarde exposé à l’ischémie froide jusqu’à 36 h.

Abstract

L’isolement des myocytes cardiaques ventriculaires des cœurs animaux et humains est une méthode fondamentale dans la recherche cardiaque. Les cardiomyocytes animaux sont généralement isolés par perfusion coronaire avec des enzymes digestives. Cependant, isoler les cardiomyocytes humains est difficile parce que les spécimens myocardiques humains ne permettent généralement pas la perfusion coronaire, et les protocoles d’isolement alternatifs entraînent de faibles rendements de cellules viables. En outre, les spécimens myocardes humains sont rares et ne sont disponibles que régulièrement dans les établissements où la chirurgie cardiaque est sur place. Cela entrave la traduction des résultats des cardiomyocytes animaux aux cardiomyocytes humains. Décrit ici est un protocole fiable qui permet l’isolement efficace des myocytes ventriculaires du myocarde humain et animal. Pour augmenter le rapport surface-volume tout en minimisant les dommages cellulaires, des tranches de tissu myocardique de 300 μm d’épaisseur sont générées à partir de spécimens myocardiaux avec un vibratome. Les tranches de tissu sont ensuite digérées avec la protéase et la collagènease. Le myocarde de rat a été employé pour établir le protocole et quantifier des rendements des myocytes viables et tolérants de calcium par le comptage de cellules fluage-cytométriques. La comparaison avec la méthode couramment utilisée en morceaux de tissu a montré des rendements significativement plus élevés de cardiomyocytes en forme de tige (41,5 ± 11,9 contre 7,89 ± 3,6 %, p < 0,05). Le protocole a été traduit par un myocarde humain défaillant et non défaillant, où les rendements étaient semblables à ceux du myocarde de rat et, encore une fois, nettement plus élevés qu’avec la méthode des morceaux de tissu (45,0 ± 15,0 contre 6,87 ± 5,23 cellules/mg, p < 0,05). Notamment, avec le protocole présenté, il est possible d’isoler un nombre raisonnable de cardiomyocytes humains viables (9–200 cellules/mg) à partir de quantités minimales de tissu (<50 mg). Ainsi, la méthode s’applique au myocarde sain et défaillant des cœurs humains et animaux. En outre, il est possible d’isoler les myocytes excitables et contractiles des spécimens de tissus humains stockés jusqu’à 36 h dans une solution cardioplégique froide, rendant la méthode particulièrement utile pour les laboratoires des établissements sans chirurgie cardiaque sur place.

Introduction

Une technique séminale qui a ouvert la voie à des idées importantes dans la physiologie cardiomyocyte est l’isolement des cardiomyocytes ventriculaires vivants des coeurs intacts¹. Les cardiomyocytes isolés peuvent être utilisés pour étudier la structure et la fonction cellulaires normales, ou les conséquences des expériences in vivo; par exemple, évaluer les changements dans l’électrophysiologie cellulaire ou le couplage excitation-contraction dans les modèles animaux de maladies cardiaques. En outre, les cardiomyocytes isolés peuvent être utilisés pour la culture cellulaire, les interventions pharmacologiques, le transfert de gènes, l’ingénierie tissulaire, et beaucoup d’autres applications. Par conséquent, les méthodes efficaces pour l’isolement cardiomyocyte sont d’une valeur fondamentale à la recherche cardiaque fondamentale et translationnelle.

Les cardiomyocytes de petits mammifères, tels que les rongeurs, et de grands mammifères, comme les porcs ou les chiens, sont généralement isolés par perfusion coronaire du cœur avec des solutions contenant des collagèneases brutes et/ou des protéases. Ceci a été décrit comme la méthode « étalon-or » pour l’isolement de cardiomyocyte, ayant pour résultat des rendements allant jusqu’à 70% des cellules viables². L’approche a également été utilisée avec les cœurs humains, résultant en rendements cardiomyocyte acceptables^3,4,5. Cependant, parce que la perfusion coronaire n’est possible que si le cœur intact ou un grand coin myocardique contenant une branche de l’artère coronaire est disponible, la plupart des spécimens cardiaques humains ne sont pas adaptés à cette approche en raison de leur petite taille et un manque de vascularisation appropriée. Par conséquent, l’isolement des cardiomyocytes humains est difficile.

Les spécimens myocardiaux humains se composent principalement de morceaux de tissu de taille variable (environ 0,5 x 0,5 x 0,5 cm à 2 x 2 x 2 cm), obtenus par biopsies endomyocardiales⁶, myectomies septales⁷, implantations VAD⁸, ou à partir de cœurs explantés⁹. Les procédures les plus courantes pour l’isolement cardiomyocyte commencent par hacher le tissu à l’aide de ciseaux ou d’un scalpel. Les contacts cellule-cellule sont ensuite perturbés par immersion dans des tampons sans calcium ou à faible teneur en calcium. Elle est suivie de multiples étapes de digestion avec des extraits d’enzymes brutes ou des enzymes purifiées comme les protéases (p. ex., la trypsine), la collagène, l’hyaluronidase ou l’élastase, entraînant une désintégration de la matrice extracellulaire et la libération des cardiomyocytes. Dans une dernière étape critique, une concentration physiologique de calcium doit être soigneusement restaurée, ou des dommages cellulaires peuvent se produire en raison du calcium-paradoxe^10,11,12. Cette approche d’isolement est pratique mais généralement inefficace. Par exemple, une étude a révélé que près d’un g de tissu myocardique était nécessaire pour obtenir un nombre suffisant de cardiomyocytes adaptés aux expériences ultérieures¹³. Une raison possible de faibles rendements est la méthode relativement dure de hacher le tissu. Cela peut particulièrement endommager les cardiomyocytes situés sur les bords des morceaux bien que ces myocytes soient les plus susceptibles d’être libérés par la digestion enzymatique.

Un autre aspect qui peut influencer l’efficacité d’isolement et la qualité des cellules obtenues à partir de spécimens humains est la durée de l’ischémie tissulaire. La plupart des protocoles mentionnent les délais de transport courts au laboratoire comme condition préalable à de bons résultats. Cela limite l’étude des cardiomyocytes ventriculaires humains aux laboratoires avec des installations de chirurgie cardiaque à proximité. Ensemble, ces restrictions entravent la vérification des résultats importants des modèles animaux dans les cardiomyocytes humains. Il est donc souhaitable d’améliorer les protocoles d’isolement qui permettent des rendements cardiomyocytes élevés à partir de petites quantités de tissus, de préférence sans dommages graves après des périodes de transport prolongées.

Décrit ici est un protocole d’isolement basé sur la digestion enzymatique de fines tranches de tissu myocardique générées avec un vibratome^14,15. Nous démontrons que l’isolement des tranches de tissu est beaucoup plus efficace que celui des morceaux de tissu hachés avec des ciseaux. La méthode décrite permet non seulement des rendements élevés de cardiomyocytes humains viables à partir de petites quantités de tissu myocardique, mais elle s’applique également aux spécimens stockés ou transportés dans une solution cardioplégique froide jusqu’à 36 h.

Protocol

Toutes les expériences avec des rats ont été approuvées par le Comité de soins et d’utilisation des animaux Mittelfranken, Bavière, Allemagne. La collecte et l’utilisation d’échantillons de tissus cardiaques humains ont été approuvées par les commissions d’examen institutionnelles de l’Université d’Erlangen-Nürnberg et du Bochum de la Ruhr-Université. Des études ont été menées conformément aux lignes directrices de la Déclaration d’Helsinki. Les patients ont donné leur consentement écri…

Representative Results

Pour vérifier l’efficacité de l’isolement, le protocole a été utilisé avec le myocarde de rat et le nombre résultant de myocytes viables a été comparé aux nombres obtenus par isolement par perfusion coronaire et par isolement de petits morceaux de tissu (isolement de morceaux, Figure 2). L’isolement et l’isolement des morceaux des tranches de tissu ont été exécutés des mêmes coeurs. Pour l’isolement par perfusion coronaire, cependant, le coeur entier a été employé….

Discussion

Bien que l’isolement des cardiomyocytes vivants ait été établi il y a plus de 40 ans et demeure une condition préalable à de nombreuses approches expérimentales dans la recherche cardiaque, il demeure une technique difficile avec des résultats imprévisibles. L’isolement cardiomyocyte par perfusion des artères coronaires avec solution enzymatique est couramment utilisé pour les cœurs de petits animaux et donne un grand nombre de cellules viables. Toutefois, cela nécessite un système et une expertise relat…

Materials

Chemicals
2,3-butanedionemonoxime	Carl Roth	3494.1	Purity>99%
Bovine serum albumin	Carl Roth	163.2
CaCl2	Carl Roth	5239.2
Creatine monohydrate	Alfa Aesar	B250009
Glucose	Merck	50-99-7
HEPES	Carl Roth	9105.3
KCl	Carl Roth	P017.1
KH2PO4	Carl Roth	3904.2
L-glutamic acid	Fluka Biochemica	49450
Low melting-point agarose	Carl Roth	6351.5
MgCl2 x 6H2O	Carl Roth	A537.1
MgSO4	Sigma Aldrich	M-7506
NaCl	Carl Roth	9265.1
NaHCO3	Carl Roth	8551.2
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
Taurine	Sigma Aldrich	T8691
Dyes
Di-8-ANEPPS	Thermo Fisher Scientific	D3167
Fluo-4 AM	Thermo Fisher Scientific	F14201
FluoVolt	Thermo Fisher Scientific	F10488
Enzymes
Collagenase CLS type I	Worthington	LS004196	Used for human tissue at 4 mg/mL (activity: 280 U/mg)
Collagenase CLS type II	Worthington	LS004176	Used for rat tissue at 1.5 mg/mL (activity 330 U/mg)
Protease XIV	Sigma Aldrich	P8038	Used for rat tissue at 0.5 mg/mL (activity ≥ 3.5 U/mg)
Proteinase XXIV	Sigma Aldrich	P5147	Used for human tissue at 0.5 mg/mL (activity: 7-14 U/mg)
Material
Cell analyzer (LSR Fortessa)	BD Bioscience	649225
Centrifuge tube, 15 mL	Corning	430790
Centrifuge tube, 50 mL	Corning	430829
Compact shaker	Edmund Bühler	KS-15 B control	Agitation direction: horizontal
Disposable plastic pasteur-pipettes	Carl Roth	EA65.1	For cell trituration use only pipettes with an inner tip diameter ≥2 mm
Forceps	FST	11271-30
Heatblock	VWR	BARN88880030
Nylon net filter, 180 µm	Merck	NY8H04700
TC Dish 100, Standard	Sarstedt	83.3902
TC Dish 35, Standard	Sarstedt	83.3900
TC Dish 60, Standard	Sarstedt	83.3901
Vibratome (VT1200S)	Leica	1491200S001	Includes VibroCheck for infrared-assisted correction of z-deflection