光変換可能なDendra2を用いた加齢C.エレガンスにおけるタンパク質代謝の定量化
Summary
ここで提示される光変換可能なフルオロフォアDendra2に融合したタンパク質ハンチンチンの分解を監視するプロトコルが提示される。
Abstract
タンパク質は、恒常性を維持するために細胞内で絶えず合成され、分解されます。目的のタンパク質の分解を監視できることは、そのライフサイクルを理解するだけでなく、プロテオスタシスネットワークの不均衡を明らかにする鍵です。この方法は、疾患を引き起こすタンパク質ハンチンチンの分解を追跡する方法を示す。Dendra2に融合したハンチンチンの2つのバージョンは、C.エレガンス神経系で発現される:生理学的バージョンまたはグルタミンの拡大および病原性ストレッチを有する1つ。Dendra2は光変換可能な蛍光タンパク質です。短い紫外線(UV)照射パルスの際に、Dendra2は、その励起/発光スペクトルを緑から赤に切り替えます。パルス追跡実験と同様に、変換された赤デンドラ2の回転率は、新たに合成された緑色Dendra2からの干渉に関係なく、監視および定量化することができる。共焦点顕微鏡を用いて、そしてC.エレガンスの光学的透明性のために、生きている、老化した生物のハンチンタン-Dendra2の劣化を監視し、定量することができる。ニューロンハンチンデンドラ2は、変換後すぐに部分的に分解され、時間の経過とともにさらにクリアされます。分解を制御するシステムは、変異型ハンチンチンの存在下で欠損し、加齢に伴ってさらに損なわれる。同じ神経系内のニューロンサブタイプは、ハンチンデンドラ2に対して異なるターンオーバー能力を示す。全体として、Dendra2に融合した関心のあるタンパク質を監視することは、その劣化および関与するプロテオスタシスネットワークのプレーヤーだけでなく、その位置、人身売買、輸送に関する重要な情報を提供することができます。
Introduction
生物のプロテオームは常に自分自身を更新しています。タンパク質は、細胞の生理的要求に応じて連続的に分解され、合成されます。一部のタンパク質は迅速に排除され、他のタンパク質はより長生きします。タンパク質のダイナミクスを監視することは、遺伝的にコード化された蛍光タンパク質(FP)を使用する場合、より簡単で正確で侵襲性の低いタスクです。FPは自己触媒的に形成され、目的の任意のタンパク質(POI)に融合することができるが、酵素を必要としない、または酸素1のために補因子を保存する必要はない。最近、新世代のFPは、決定された波長の光パルスで照射時に色を切り替える設計を行いました。これらの光活性化可能なFP(PAFP)は、POI、またはそれらが存在するオルガネラまたは細胞の標識および追跡を可能にし、そしてそれらの定量的および/または質的パラメータ2を調べることを可能にする。FPは、POIの動き、方向性、移動速度、拡散係数、移動画分対不動分数、1つのセルラーコンパートメントに存在する時間、および回転率を追跡することを可能にします。特定のオルガネラの場合、移動および輸送、または核分裂および核融合事象を決定することができる。特定のセルタイプでは、セルの位置、分割率、体積、形状を設定できます。重要なことに、PAFPの使用は、連続的な視覚化なしで、新しく合成されたプローブからの干渉なしに追跡を可能にする。細胞および生物全体の研究は、がんや転移の発生、細胞骨格の組み立てまたは分解、RNA-DNA/タンパク質相互作用3などの生体内の問題に対処するためにPAFPをうまく採用している。本稿では、軽い顕微鏡法とPAFPを用いて、神経変性疾患のC.エレガンスモデルにおいて生体内の凝集しやすいタンパク質ハンチンチン(HTT)の回転率を明らかにする。
ここで説明するプロトコルは、融合タンパク質ハンチン-デンドラ2(HTT-D2)の安定性および分解を定量化する。Dendra2は、UVまたは可視青色光のいずれかに応答して発光/励起スペクトルを緑色から赤色に不可逆的に切り替える第2世代単量体PAFP4であり、その強度は最大4,000倍5、66に増加する5。ハンチンチンは、ハンチントン病(HD)、致命的な遺伝性神経変性疾患を引き起こす原因となるタンパク質です。ハンチンエキソン-1は、グルタミンのストレッチが含まれています (CAG, Q).タンパク質が39Q以上で発現すると、変異体、有毒、病原性タンパク質に誤って折り畳まれ、タンパク質が誤って発現します。変異HTTは凝集しやすく、ニューロン細胞死および変性を招き、短いオリゴマー種として、またはより大きな高度に構造化されたアミロイド7と同じである。
線虫は、その操作の容易さ、アイソジェニックな性質、短い寿命、および光学的透明性8のおかげで老化と神経変性を研究するためのモデルシステムである。生体内でHTTの安定性を研究するために、C.エレガンスの神経系に融合構造が発現した。25Qs(HTTQ25-D2)の生理学的ストレッチまたは97Qs(HTTQ97-D2)の病理学的ストレッチのいずれかを含むHTT-D2トランスジーンは、線虫の寿命9を通して汎ニューロンを過剰発現する。生きたC.エレガンスを短く焦点を合わせた光の点に当てることによって、単一のニューロンが光交換され、変換されたHTT-D2が時間の経過とともに追跡される。HTT-D2分解量を確立するために、新たに変換されたHTT-D2の赤色信号との差は、決定された期間の後のHTT-D2の残りの赤色信号と比較される。したがって、その生理学的形態と比較して、ハンチンチンが拡大し、有毒な形態で見つかった場合にどのように分解されるかを調べることができ、その結果として、より多くのハンチンチンが分解される可能性があります。Q97対Q25の存在に対して、前ニューロンまたは後部ニューロンがどのように異なって反応するか、特に長期間にわたって。老化時のプロテオスタシスネットワーク(PN)の崩壊が分解率の違いにどう寄与しているか。これらの結果は、HTT-D2の売上高に関する少数の観測値のみを記述します。しかし、タンパク質凝集とプロテオスタシスの両方の分野に関連する多くの生物学的な質問は、このin vivoアプリケーションで対処することができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
タンパク質の機能を理解するには、その合成、位置、分解を理解することが重要です。新しく、安定した、明るいFPの開発に伴い、POIの可視化と監視がより簡単かつ効率的になりました。Dendra2のような遺伝的に発現した融合PAFPは、POIの安定性を研究するためにユニークに配置されています。紫色の青色光に曝されると、Dendra2は保存されたアミノ酸のトライアド内の正確な位置で壊れます。?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、DFG(KI-1988/5-1からJK、ニューロキュア・ド・エクセレンス・クラスター・オブ・エクセレンス・オブ・エクセレンス・オブ・MLPによるニューロキュア博士フェローシップ)の資金調達を認めています。また、ライプニッツ分子薬理研究所ベルリン(FMP)のイメージングコア施設が、イメージングを提供していることを認めます。また、Dendra2システムを設置し、指示を提供してくれたディオゴ・フェレシアーノさんに感謝申し上げたいと思います。
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
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