In Vivo Quantifizierung des Proteinumsatzes im Alter C. Elegans mit Photoconvertible Dendra2
Summary
Hier wird ein Protokoll zur Überwachung des Abbaus des mit dem photokonvertierbaren Fluorophor Dendra2 verschmolzenen Proteins Huntingtin vorgestellt.
Abstract
Proteine werden in einer Zelle ständig synthetisiert und abgebaut, um die Homöostase aufrechtzuerhalten. Die Möglichkeit, den Abbau eines Proteins von Interesse zu überwachen, ist der Schlüssel, um nicht nur seinen Lebenszyklus zu verstehen, sondern auch Ungleichgewichte im Proteostase-Netzwerk aufzudecken. Diese Methode zeigt, wie man den Abbau des krankheitserregenden Proteins Huntingtin nachverfolgt. Zwei Versionen von Huntingtin, die zu Dendra2 verschmolzen sind, werden im Nervensystem C. elegans ausgedrückt: eine physiologische Version oder eine mit einer erweiterten und pathogenen Strecke von Glutaminen. Dendra2 ist ein photokonvertierbares fluoreszierendes Protein; Bei einem kurzen ultravioletten (UV) Bestrahlungsimpuls schaltet Dendra2 seine Anregungs-/Emissionsspektren von grün auf rot. Ähnlich wie bei einem Puls-Chase-Experiment kann der Umsatz des umgebauten Rot-Dendra2 unabhängig von der Interferenz durch neu synthetisiertes Grün-Dendra2 überwacht und quantifiziert werden. Mit konfokaler Mikroskopie und aufgrund der optischen Transparenz von C. elegansist es möglich, den Abbau von Huntingtin-Dendra2 in einem lebenden, alternden Organismus zu überwachen und zu quantifizieren. Neuronale Huntingtin-Dendra2 wird kurz nach der Umwandlung teilweise abgebaut und im Laufe der Zeit weiter gerodet. Die Systeme, die den Abbau kontrollieren, sind in Gegenwart von mutiertem Huntingtin mangelhaft und durch das Altern weiter beeinträchtigt. Neuronale Subtypen innerhalb desselben Nervensystems weisen unterschiedliche Umsatzkapazitäten für Huntingtin-Dendra2 auf. Insgesamt kann die Überwachung jedes Proteins von Interesse, das zu Dendra2 verschmolzen ist, wichtige Informationen nicht nur über seine Verschlechterung und die Akteure des beteiligten Proteostase-Netzwerks liefern, sondern auch über seinen Standort, seinen Menschenhandel und seinen Transport.
Introduction
Das Proteom eines lebenden Organismus erneuert sich ständig. Proteine werden kontinuierlich abgebaut und entsprechend dem physiologischen Bedarf einer Zelle synthetisiert. Einige Proteine werden schnell eliminiert, während andere länger gelebt werden. Die Überwachung der Proteindynamik ist eine einfachere, genauere und weniger invasive Aufgabe bei der Verwendung genetisch kodierter fluoreszierender Proteine (FPs). FPs bilden sich autokatalytisch und können mit jedem Protein von Interesse (POI) verschmolzen werden, erfordern aber keine Enzyme, um Kofaktoren zu falten oder zu benötigen, außer Sauerstoff1. Eine neuere Generation von FPs wurde vor kurzem entwickelt, um die Farbe bei Bestrahlung mit einem Lichtimpuls von bestimmter Wellenlänge zu schalten. Diese photoaktivierbaren FPs (PAFPs) ermöglichen die Kennzeichnung und Nachverfolgung von POIs oder der Organellen oder Zellen, in denen sie sich befinden, und ihre quantitativen und/oder qualitativen Parameter zu untersuchen2. FPs ermöglichen es, die Bewegung, Die Richtung, die Bewegungsrate, den Diffusionskoeffizienten, die beweglichen oder unbeweglichen Fraktionen, die Zeit, zu der sie sich in einem Mobilfunkfach befindet, sowie die Fluktuationsrate zu verfolgen. Für bestimmte Organellen können Fortbewegung und Transport oder Spalt- und Fusionsereignisse bestimmt werden. Für einen bestimmten Zelltyp können die Position, die Division, das Volumen und die Form einer Zelle festgelegt werden. Entscheidend ist, dass die Verwendung von PAFPs tracking ohne kontinuierliche Visualisierung und ohne Interferenzen von neu synthetisierten Sonden ermöglicht. Studien sowohl an Zellen als auch an ganzen Organismen haben ERFOLGREICH PAFPs eingesetzt, um biologische Fragen in vivo zu behandeln, wie die Entwicklung von Krebs und Metastasen, die Montage oder Demontage des Zytoskeletts und DIE INTERAKTIONen zwischen RNA-DNA/Protein3. In diesem Manuskript werden Lichtmikroskopie und PAFPs verwendet, um die Fluktuationsraten des aggregationsanfälligen Proteins Huntingtin (HTT) in vivo in einem C. elegans Modell neurodegenerativer Erkrankungen aufzudecken.
Das hier beschriebene Protokoll quantifiziert die Stabilität und den Abbau des Fusionsproteins huntingtin-Dendra2 (HTT-D2). Dendra2 ist eine monomere PAFP4 der zweiten Generation, die ihre Emissions-/Erregungsspektren als Reaktion auf UV oder sichtbares blaues Licht irreversibel von grün auf rot umstellt, mit einer Erhöhung ihrer Intensität um bis zu 4.000-fache5,6. Huntingtin ist das Protein, das für die Huntington-Krankheit (HUNTINGTON), eine tödliche erbliche neurodegenerative Störung, verantwortlich ist. Huntingtin exon-1 enthält eine Strecke von Glutaminen (CAG, Q). Wenn das Protein mit über 39Q exprimiert wird, wird es zu einem mutierten, toxischen und pathogenen Protein verkommen. Mutante HTT ist anfällig für Aggregation und führt zu neuronalen Zelltod und Degeneration, entweder als kurze oligomere Arten oder als größere hoch strukturierte Amyloide7.
Das Nematode ist ein Modellsystem zur Untersuchung von Alterung und Neurodegeneration dank seiner einfachen Manipulation, isogenen Natur, kurzen Lebensdauer und seiner optischen Transparenz8. Um die Stabilität von HTT in vivo zu untersuchen, wurde ein Fusionskonstrukt im Nervensystem von C. elegansausgedrückt. Ein HTT-D2-Transgen, das entweder eine physiologische Dehnung von 25Qs (HTTQ25-D2) oder eine pathologische Strecke von 97Qs (HTTQ97-D2) enthält, wird während der gesamten Lebensdauer der Nematode panneuronal überexprimiert9. Durch die Unterwerfung von lebenden C. elegans einem kurzen und fokussierten Lichtpunkt wird ein einzelnes Neuron photoswitched und der konvertierte HTT-D2 im Laufe der Zeit verfolgt. Um die Menge an HTT-D2 abgebaut zu ermitteln, wird die Differenz zwischen dem roten Signal des frisch umwandelten HTT-D2 mit dem verbleibenden roten Signal von HTT-D2 nach einem bestimmten Zeitraum verglichen. Daher wird es möglich zu untersuchen, wie Huntingtin abgebaut wird, wenn es in seiner erweiterten und toxischen Form im Vergleich zu seiner physiologischen Form gefunden wird; wie vordere oder hintere Neuronen unterschiedlich auf das Vorhandensein von Q97 im Vergleich zu Q25 reagieren, insbesondere über längere Zeiträume; und wie der Zusammenbruch des Proteostase-Netzwerks (PN) während des Alterns zu den Unterschieden bei den Abbauraten beiträgt. Diese Ergebnisse beschreiben nur eine kleine Reihe von Beobachtungen zum Umsatz von HTT-D2. Mit dieser In-vivo-Anwendung können jedoch viele weitere biologische Fragen behandelt werden, die sowohl für den Bereich der Proteinaggregation als auch für die Proteostase relevant sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um die Funktion eines Proteins zu verstehen, ist es wichtig, seine Synthese, Seinen Standort und seine Degradation zu verstehen. Mit der Entwicklung neuartiger, stabiler und heller FPs ist die Visualisierung und Überwachung von POIs einfacher und effizienter geworden. Genetisch exprimierte Fusions-PAFPs wie Dendra2 sind einzigartig positioniert, um die Stabilität eines POI zu untersuchen. Bei der Exposition gegenüber lila-blauem Licht bricht Dendra2 an einer genauen Stelle innerhalb eines Dreiklangs konservierter Amin…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir würdigen die DFG (KI-1988/5-1 to JK, NeuroCure PhD fellowship by the NeuroCure Cluster of Excellence to MLP) für die Förderung. Wir würdigen auch die Imaging Core Facility des Leibniz-Forschungsinstituts für Molekulare Pharmakologie Berlin (FMP) für die Bereitstellung der Bildgebung. Darüber hinaus möchten wir uns bei Diogo Feleciano bedanken, der das Dendra2-System im Labor aufgebaut und Anweisungen gegeben hat.
Materials
| Agar-Agar Kobe I | Carl Roth GmbH + Co. KG | 5210.2 | NGM component |
| Agarose, Universal Grade | Bio & Sell GmbH | BS20.46.500 | Mounting slide component |
| BD Bacto Peptone | BD-Bionsciences | 211677 | NGM component |
| Deckgläser-18x18mm | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0657.2 | Cover slips |
| EC Plan-Neufluar 20x/0.50 Ph2 M27 | Carl Zeiss AG | Objective | |
| Fiji/ImageJ 1.52p | NIH | Analysis Software | |
| Levamisole Hydrochloride | AppliChem GmbH | A4341 | Anesthetic |
| LSM710-ConfoCor3 | Carl Zeiss AG | Laser Scanning Confocal Micoscope | |
| Mounting stereomicroscope | Leica Camera AG | Mounting microscope | |
| neuronal-HTTQ25-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| neuronal-HTTQ97-Dendra2 | this paper | C. elegans strain | |
| OP50 Escherichia coli | CAENORHABDITIS GENETICS CENTER (CGC) | OP50 | Nematode food source |
| Sodium Chloride | Carl Roth GmbH + Co. KG | 3957.2 | NGM component |
| Standard-Objektträger | Carl Roth GmbH + Co. KG | 0656.1 | Glass slides |
| ZEN2010 B SP1 | Carl Zeiss AG | Confocal acquisition software |
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