Summary
스트레스가 많은 삶의 사건은 인지 기능을 손상시켜 정신 장애의 위험을 증가시다. 이 프로토콜은 스트레스가 남성과 여성 스프라그 Dawley 쥐의 패러다임을 이동하는 자동화 된 조작 전략을 사용하여 인지 유연성에 미치는 영향을 보여줍니다. 특정 행동의 기본 특정 뇌 영역논의, 결과의 번역 관련성을 탐구.
Abstract
스트레스는 인지 기능에 영향을 미칩니다. 스트레스 향상 또는 인지 기능 손상 여부 여러 요인에 따라 달라 집니다., 포함 하 여 1) 유형, 강도, 그리고 스트레스의 기간; 2) 연구 하에 인지 기능의 종류; 및 3) 인지 작업을 학습하거나 실행하는 것에 관한 스트레스의 타이밍. 또한, 인지 기능에 스트레스의 효과 사이 섹스 차이 널리 문서화 되었습니다. 여기에 설명된 것은 스트레스의 변화가 남성과 여성 스프라그 Dawley 쥐의 인지 유연성에 어떤 영향을 미치는지 평가하기 위해 패러다임을 이동하는 자동화 된 조작 전략의 적응입니다. 특히, 구속 스트레스는 스트레스가 남녀 모두인지 성능에 미치는 영향을 조사하기 위해이 작동 기반 작업에서 훈련 전이나 후에 사용됩니다. 이 자동화된 패러다임의 각 작업과 관련된 특정 뇌 영역은 잘 확립되어 있다(즉, 내측 전두엽 피질 및 궤도 피질). 이것은 패러다임의 완료시 이 지구에 있는 특정 유전자 및 단백질의 실험 또는 평가 도중 표적으로 한 조작을 허용합니다. 이 패러다임은 또한 신경 기판을 정의한 각각의 스트레스 후에 발생하는 다양한 유형의 성능 오류를 감지할 수 있게 합니다. 또한 확인된 반복 구속 스트레스 패러다임 후 인내 오류에 뚜렷한 성다름이 있습니다. 전임상 모델에서 이러한 기술의 사용은 스트레스가 뇌에 어떻게 영향을 미치는지 알 수 있으며 외상 후 스트레스 장애 (PTSD) 및 주요 우울 장애 (MDD)와 같은 정신 장애의 인식이 손상되는 방법을 밝힐 수 있으며 유병률에서 표시된 성 차이를 표시합니다.
Introduction
인간에서 스트레스가 많은 삶의 이벤트는 인지 기능(즉, 인지 유연성1)을손상시킬 수 있으며, 이는 환경에서 새로운 조건에 직면하기 위해 인지 처리 전략을 조정하는 능력을 나타낸다2. 인지의 장애는 외상 후 스트레스 장애(PTSD) 및 주요 우울 장애(MDD)3,4와같은 많은 정신 질환을 침전시키고 악화시다. 이무질서는 여성5,6,7,8에서두 번 널리 퍼져 있습니다, 그러나 이 격차에 대한 생물학 기초는 알려지지 않았습니다. 인간에서 집행 기능의 측면은 위스콘신 카드 정렬 작업, 인지 유연성의 데모를 사용하여 평가 할 수있다2. 이 작업의 성능은 PTSD9 및 MDD10환자에서 손상되지만, 이러한 변화의 신경 기초는 뇌 이미징11에의해서만 검사될 수 있다.
스트레스가 뇌에 미치는 영향을 이해하는 발전은 동물 모델, 특히 설치류의 사용을 통해 이루어졌습니다. 인지 유연성은 스트레스 관련 질병에 영향을, 그것은 설치류에서 검사 하는 매우 관련 된 표현형. 현재까지, 대부분의 스트레스 신경 생물학 문학은 대체 인지 유연성 패러다임 (때로는 파고 작업이라고도 함)12,13,14,15를사용했다. 이 작업은 광범위하게 심사되었지만, 설치류를 훈련하기 위해 실험자가 더 많은 시간과 노력이 필요합니다. 여기에 적응하고 설명된 다양한 스트레스 모델17,18을 사용하여 남성과 여성 스프라그 Dawley 쥐의 인지 유연성을 평가하기 위한 잘 확립된 자동 설정 이동프로토콜(16)이있다. 이 절차는 실험자의 최소한의 감독이 필요하며 여러 마리의 쥐를 동시에 테스트할 수 있습니다. 또한 이 자동화 된 작업(19)의다른 버전과 달리이 패러다임의 적응은 3 일의 교육만 필요하며 효율적인 프로그래밍 된 데이터 분석을 포함합니다.
스트레스가 인지 기능을 향상시키거나 손상시키는지 여부는 스트레스의 유형, 강도 및 지속 시간뿐만 아니라 인지작업(20,21)을학습하거나 실행하는 것과 관련하여 스트레스의 타이밍에 따라 달라집니다. 따라서 프로토콜은 작동 훈련 전후에 스트레스 절차를 통합합니다. 또한 스트레스 연구의 대표적인 결과를 검사합니다. 또한, 세트 시프트의 특정 측면의 근본적인 뇌 영역은 잘 확립되어있다 2,16,22; 따라서, 보고서는 또한 스트레스 및 전략 이동 절차 도중 또는 후에 특정 두뇌 지구를 표적으로 하고 평가하는 방법을 설명합니다.
인지유연성(18,23)에서성차이를 직접 검사하는 데 대한 연구가 제한되어 있다. 프로토콜은 1) 실험 패러다임에 남성과 여성 쥐를 통합하는 방법을 설명, 다음 2) 자유롭게 사이클링 여성의 절차 전후와 동안 에스트라스트 사이클을 추적. 이전 연구는 오페라 훈련 전에 스트레스는 쥐에 인지 유연성에 섹스 특정 적자로 이어질 수 있음을 나타냈다17. 특히, 여성 쥐는 스트레스 후 인지 유연성에 장애를 전시, 인지 유연성 스트레스 후 남성 쥐에서 향상 하는 반면17. 흥미롭게도, 인간에 있는 성 편향된 부각이 있는 긴장 관련 정신 장애의 중요한 특징은, 인식융통성입니다. 이러한 결과 제안 여성 남성 보다 인지 장애의이 유형에 더 취약 할 수 있습니다. 동물 모델에서 이러한 기술의 사용은 뇌에 스트레스의 효과와 어떻게 인간에서 정신 장애에 인식 손상에 빛을 발산 할 것 이다.
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Protocol
이 연구의 모든 절차는 브린 모어 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 실험실 동물을 주문하고 실험을 시작하기 전에 IACUC 또는 기타 적용 가능한 규제 승인을 얻습니다.
1. 동물 준비
- 남성과 여성 성인 스프라그 Dawley 쥐를 취득.
참고: 쥐는 65일 전에 전달될 수 있지만, 이 시점 이점 이후에는 남성과 여성 모두 완전히 성숙하도록 절차를 시작하지 마십시오. - 쌍 집 동성 쥐 가능한 한 오랫동안, 장기 고립은 스트레스24입니다. 음식 제한의 경우, 조작 전략 이동 프로토콜 직전에 쥐를 집.
- 1주 간의 적응 후, 하루에 3-5분 동안 쥐를 부드럽게 다루기 시작합니다. 각 쥐의 체중을 수집합니다. 추가적으로, 어떻게 gonadal 호르몬 결과 영향을 미칠 수 있습니다 평가에 관심이 있다면, 여성 쥐에 대 한 질 용 암을 수집 (섹션에 설명 2).
- 훈련이 시작되기 최소 3일 전에 패러다임을 이동하는 작동 전략에서 실행될 동물(음식에서) 동물을 제한하여 작업을 성공적으로 학습합니다. 물을 항상 자유롭게 사용할 수 있는지 확인하십시오. 매일 음식과 유체 소비, 수화 상태 및 프로토콜에서 동물의 일시적 또는 영구 제거를 위한 기준으로 사용되는 모든 행동 및 임상 변화를 문서화하기 위해 각 동물에 대한 서면 기록을 유지해야합니다 (Morton 2000; NRC 2003b).
- 훈련 전 3일 이상 스트레스 절차를 사용하는 경우, 스트레스일 수(예: 5일 구속+식품 제한25)에맞게 식품 제한을 조정합니다.
- 매일, 일반 일일 음식 섭취량의 80%를 제공합니다(즉, 체중 100g당 4g의음식)을 26. 쥐에 대한 일일 체중 컬렉션을 사용하여 매일 얼마나 많은 음식을 줄수 있는지 계산합니다.
- 교육 및 테스트 일을 통해 식품 제한을 계속합니다. 그러나 쥐가 하루 동안 훈련이나 테스트를 완료 할 때까지 홈 케이지에 음식을 배치하지 마십시오, 또는 그렇지 않으면 그들은 음식 펠릿 보상에 대한 작업을 수행하도록 동기를 부여하지 않습니다. 작업이 완료되면 쥐에게 음식 배달의 타이밍이 상당히 예측할 수 있는지 확인이 (단순히 나중에 홈 케이지에서 음식을 기다리는 찬성) 작동 챔버에서 수행 할 수있는 감소 된 동기 부여를 방지하는 데 도움이되기 때문에.
참고 : 구속 스트레스 패러다임을 겪고있는 동물은 제어, 스트레스되지 않은 과목보다 훨씬 더 큰 체중 감소를 나타내지 않습니다. 그러나, 다양 한 스트레스 절차 스스로 체중 감소를 유도 할 수 있습니다., 체중 기반 식품 제한 하는 동안 스트레스 대응 보다 적은 음식을 받는 쥐의 결과. 이것은 추가, 혼란 스트레스를 제시 할 수있다. 이 경우, 또는 무게27에관계없이 각 피험자에 주어진 음식의 고정 된 금액을 사용합니다.
2. 질 용암
참고: Gonadal 호르몬 (즉, 에스트로겐 및 황체 호르몬)은 스트레스 반응 및 인식28,29,30에영향을 미치는 것으로 알려져 있습니다. 이 호르몬은 여성 쥐의 스트라스트 주기 동안 변동31. 스트레스 나 인지 유연성 데이터와 상관 관계를 자유롭게 사이클링 여성 설치류의 estrous 주기를 추적에 관심이 있다면, 아래 설명 과 같이 질 용암을 수집. estrous 주기 단계를 고려 한 대표 데이터는 제공되지 않습니다.
- 암컷으로부터 질 용암 샘플을 얻으려면 깨끗한 비커, 유리 안면 집약기, "라베지" 슬라이드(암경 페인트 원이 있는 현미경 슬라이드) 및 빈 비커 1개에 따뜻한 물을 모으십시오.
- 소량의 따뜻한 물(~0.5mL)으로 안약증을 채운 다음, 팁을 암컷 쥐의 질에 삽입합니다(꼬리를 들어 올려). 멸균 물을 2x-3배 배출하고 수집된 액체를 현미경 슬라이드에 추방합니다. 라베지 슬라이드 원을 오버플로하지 마십시오.
- 여분의 액체를 빈 비커에 추방합니다. 래트 번호로 라베지 슬라이드에 라벨을 부착하고 각 쥐의 샘플을 해당 순서로 넣어 각 쥐에 속하는 샘플이 분명하도록 합니다.
- 깨끗한 따뜻한 물을 피펫팅하고 다음 쥐를 샘플링하기 위해 안약증을 채우기 전에 "과잉"비커에 여러 번 분배하여 안약증을 철저히 헹구십시오.
- 조심스럽게 용암 슬라이드를 밝은 필드 현미경으로 운반하여 용암 샘플을 이미지화하고 베커 외31에설명된 바와 같이 에스트라스트 사이클 내에서 하루를 분류한다.
참고 : 이상적으로, 라베이징은 여성의 주기를 제대로 추적하기 위해 몇 주 동안 수행해야하며 circadian 리듬을 제어하기 위해 매일 매우 유사한 시간에 수행해야합니다. 바람직하게는, 이 절차는 응력 및 작동 전략 이동 절차 전에 수행되어야 합니다. 면 봉면과 멸균 식염수의 사용은 또한이 눈 방울 무비 기법의 대안으로 사용할 수 있습니다. 여성 쥐에 대한 데이터는 estrous 주기 일에 따라 포스트 혹을 분석 할 수 있습니다 (스트레스가 수행될 때 주기일 및 / 또는 테스트가 발생할 때 주기의 날을 고려하십시오).
3. 장비 및 소프트웨어
- 행동 훈련 및 테스트를 위해 작동 챔버를 사용합니다.
- 챔버위에 두 개의 자극 등이 있는 개폐식 레버, 집 조명 및 이러한 작업을 보강하기 위한 디스펜서가 포함되어 있는지 확인합니다.
- 레버가 중앙 보강 전달 영역의 양쪽에 있는지 확인하고 각 레버 위에 하나의 자극 광이 있습니다.
- 집 빛을 사용하여 빛 자극의 감지를 방해하지 않고 챔버를 조명하십시오 (집 빛이 레버와 자극 등 반대의 챔버의 뒷벽에 있는 것이 가장 좋습니다).
- 먼지가 없는 식품 펠릿(여기, 45 mg 펠릿이 사용됩니다: 18.7% 단백질, 5.6% 지방, 4.7% 섬유) 식품 제한 쥐의 보강을 위해. 자당이나 지방이 높은 펠릿을 사용하지 마십시오 (스트레스가 맛있는 음식 섭취에 미치는 영향에 관심이 없다면).
- 챔버(재료표)를작동할 수 있는 소프트웨어로 컴퓨터에서 자극, 레버 작동 및 데이터 수집의 프리젠테이션을 제어합니다.
참고: 이 소프트웨어를 사용하는 프로그램 코딩과 관련된 정보는 작성자에게 문의하십시오. MED-PC 스크립트는 추가 파일로 포함됩니다. 이 소프트웨어는 각 시험 (레버가 누르는 것, 올바른 / 부정확한 응답인지 여부 및 선택을 위한 대기 시간)에 대한 동물의 반응에 대한 정보를 수집합니다. 이 정보로부터 사용자는 행동 분석 섹션에 설명된 대로 행동 패러다임에서 다양한 측정값을 계산할 수 있습니다. - 스트레스호르몬32 (및 기타 관련 조치)에서 circadian 리듬을 제어하기 위해 매일 같은 시간에 훈련 / 테스트를 수행합니다.
- 각 조작 상자의 하단 트레이에 신선한 침구를 채우고 대변 / 폐기물을 수집합니다. 각 세션에 따라 각 트레이, 깨끗한 트레이 및 챔버 내부를 알코올 물티슈 또는 IACUC 승인 소독제로 덤프하고 새로운 동물을 챔버에 넣기 전에 신선한 침구로 교체하십시오.
4. 스트레스 절차
- 패러다임을 이동하는 작동 전략 이동에 대한 훈련 전, 도중 및/또는 훈련 후 스트레스 절차를 수행해야 하는지 여부를 결정합니다(예: 3일간의 작동 훈련 전 의 구속 응력 과 3일간의 작동 훈련 및 단일 구속 및 테스트).
- 작동 학습과 관련하여 매일 동시에 응력 절차를 실행합니다. (예를 들어, 9A.M에서 시작하여 30분 동안 구속 응력, 그 다음으로 작동 챔버에 배치).
- 콜로니 룸과 전략 이동 패러다임 룸에서 별도의 방에서 스트레스 절차를 수행 (목격자 스트레스와 관련된 혼란 요인이 없는지 확인하기 위해)33. 간단히 말해서, 쥐를 브룸 스타일의 투명 구속 튜브에 넣고 개구부를 밀봉하여 팔다리나 꼬리를 꼬지 않도록 주의하십시오. 각 피사체 사이에 IACUC 승인 소독제를 사용하여 브룸 스타일의 튜브를 청소하십시오. 부적절한 소독은 페로몬을 뒤로 하고 테스트 프로토콜에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다.
참고: 쥐의 첫 번째 그룹이 작동 챔버에서 얼마나 오래 보낼지 추정합니다. 이는 훈련 과 시험일에 따라 달라집니다. 그러나 여러 코호트를 실행한 후 각 작업을 완료하여 향후 작업을 추정하는 데 평균 시간을 계산할 수 있습니다. - 얼마나 많은 조작 챔버를 사용할 수 에 따라, 과목에 대 한 스트레스 절차를 비틀거. 예를 들어, 4마리의 쥐는 구속 스트레스를 받고 4개의 수술실에 배치됩니다. 한 시간 후, 4 마리의 동물이 스트레스 절차를 거쳐 수술 챔버가 뒤따릅니다.
5. 교육
참고: 이 패러다임은 플로레스코 등에서 개발한 작동식 설정 이동 절차에서 수정되어3일 19일에완료될 수 있다. 쥐에 대 한 훈련 절차는 3 일 (아래 설명 된 대로 각 작업을 배울 1 일)가 필요합니다. 쥐가 이러한 작업을 배우지 않는 것은 드문 일이 아닙니다. 쥐가 각 작업을 학습하지 못하면 최종 연구에서 제외해야 합니다. 아래 설명된 트레이닝 패러다임의 시각적 묘사는 그림 1A를 참조하십시오.
- 챔버에 쥐를 배치하기 전에 디스펜서에 충분한 음식 펠릿이 있고 작동 상자가 제대로 작동하는지 확인하십시오. 이를 위해 빈 챔버에서 교육 또는 테스트 일 프로그램을 로드하고 시작하여 올바른 레버가 레버 프레스당 하나의 보상을 적절히 제공한다는 것을 수동으로 테스트합니다.
- 각 레버를 누르기 위해 쥐 훈련
- 훈련 첫날 에 상자에 쥐를 넣기 전에 각 챔버 내에서 훈련 절차를로드 할 때 지정된 대로 올바른 레버에 하나의 음식 펠릿 보상을 수동으로 설정합니다.
- 고정 비율(FR-1) 스케줄을 사용하여 쥐를 훈련시켜 각 올바른 레버 프레스는 하나의 보강으로 보상됩니다. 챔버를 작동하는 컴퓨터에서 훈련 절차를 로드할 때 올바른 레버를 지정하여 피사체 및/또는 실험 조건(한 번에 하나의 레버만 형성)에 걸쳐 하루에 올바른 레버를 균형을 맞니다.
- 쥐가 올바른 레버 50x를 눌러 기준에 도달할 때까지 레버를 누르면 일반적으로 30-45분 사이의 작업을 완료합니다.
- 다음 날은 쥐가 훈련 첫날과 동일한 프로그램을 사용하여 반대 레버에서 이 작업을 수행하도록 강요하지만 반대 레버를 올바른 레버로 지정합니다. 훈련 당일 에 음식 펠릿으로 레버를 "형성"할 필요가 없습니다. 일반적으로, 이 기준은 쥐가 첫번째 레버를 누르는 것을 배운 후에 빨리 취득됩니다.
- 라이트 큐에 반응하기 위해 쥐 훈련
- 훈련 셋째 날에는 쥐가 레버 중 하나를 눌러 잠재적으로 음식 펠릿 보상을 받을 수 있는 15s 시험을 위해 두 레버 위의 빛을 조명합니다. 가벼운 차별 작업 중에 이 프로그램은 시험별로 올바른 레버를 임의로 선택합니다.
- 쥐가 올바른 레버를 누르면 조명이 3s에 대해 조명을 켜고 보상이 전달되고 5s 기간이 다음 시험 전에 조명이 꺼지는지 확인합니다. 쥐가 잘못된 레버를 누르면 보상이 전달되지 않고 다음 시험 보다 10s에 대한 조명이 꺼져 있는지 확인합니다.
- 훈련 마지막 날에 이어, 쥐가 레버 프레스의 총 수로 나눈 레버의 프레스 수를 나누어 쥐가 왼쪽 또는 오른쪽 레버에 대한 선호도가 있는지 여부를 결정하기 위해 "측면 바이어스"를 계산합니다. 시험 당일, 쥐는 선호하는 레버에 반응하기보다는 특정 응답 보상 비상 사태를 학습하고 있는지 확인하기 위해 가장 선호하는 측면에서 시작됩니다.
6. 테스트
참고: 아래에 설명된 테스트 패러다임의 시각적 묘사는 그림 1B를 참조하십시오.
- 4일째(시험일)에는 스트레스 절차에 따라 쥐를 수술실에 배치하고 측면 차별, 측면 반전 및 가벼운 차별 작업을 연일 검사합니다. 빛 차별 작업이 "올바른" 레버 위의 빛만 비추도록 합니다. 각 작업에서 쥐는 보상되지 않고 잘못된 레버를 누르지 않고 각 차별을 완료하기 위해 8 번의 올바른 시험을 연속적으로 달성해야합니다. 잘못된 레버 프레스가 이 시험 체인을 재설정합니다.
- 측면 차별 작업을 사용하여 쥐를 테스트합니다. 측면 차별 프로그램을 사용하여, 빛 큐에 관계없이 훈련의 셋째 날부터 결정된 대로 가장 선호하는 측면에서 레버를 누르는 쥐에게 보상하십시오. 작업은 올바른 레버를 8배 연속으로 누르면 종료됩니다(누락 제외).
- 측면 차별 프로그램을 사용하여 쥐를 다시 실행하여 측면 반전 테스트를 수행하지만, 이번에는 측면 차별 작업에서 올바른 레버를 올바른 것으로 지정합니다. 라이트 큐에 관계없이 쥐가 이 레버를 눌러 보상을 받을 수 있는지 확인합니다. 작업은 올바른 레버를 8배 연속으로 누르면 종료됩니다(누락 제외).
- 위에 비추는 빛으로 레버를 눌러 쥐에게 보상하는 가벼운 차별 작업을 수행합니다. 각 작동 테스트는 올바른 레버를 8배 연속으로 누르면 완료됩니다(누락 제외).
참고: 이전 연구에 따르면, 이러한 작업은 연속 프레스에 관계없이 최소 30번의 시험을 인코딩하여 쥐가 각작업(18)의규칙을 배울 수 있는 충분한 시간을 갖도록 합니다. 따라서 30번의 시험이 발생하기 전에 쥐가 8번의 올바른 시험을 연속으로 달성하면 30번의 시험이 완료될 때까지 작업이 계속 진행됩니다.
7. 행동 분석
참고: 각 작업에 대한 MED-PC 스크립트가 시작되고 완료될 수 있는 한 테스트 당일 각 동물에 대해 수집된 데이터는 자동으로 기록되고 컴퓨터에 저장됩니다(MED-PC 스크립트에 대한 보충 자료 참조).
- 컴퓨터 프로그램을 사용하여 각 테스트 일 작업(측면 차별, 측면 반전 및 가벼운 차별)에 대한 데이터를 엽니다. 프로그램에 의해 기록 된 주요 조치는 기준에 대한 시험, 기준의 오류 및 기준 시간입니다. 이러한 조치는 아래에 자세히 설명되어 있습니다.
참고: 저자는 분석 프로세스의 자동화뿐만 아니라 인내 및 회귀 오류의 분석을 허용하는 MATLAB 스크립트를 생성했습니다(데이터 분석을 간소화하기 위한 코드 정보에 대한 연락처 작성자).- 시험을 사용하여 측정 (쥐가 8 번의 시험을 포함하여 8 개의 올바른 시험을 연속적으로 완료하는 데 필요한 총 시험 횟수 (누락 포함 되지 않음)를 정확도의 주요 지표로 사용합니다. 이 데이터는 테스트 당일에 MED-PC 스크립트에서 생성된 데이터 파일의 배열 B의 첫 번째 열에 있습니다.
- 각 작업 중에 발생한 총 오류를 검사합니다. 이 데이터는 테스트 당일에 MED-PC 스크립트에서 생성된 데이터 파일의 배열 B의 세 번째 열에 있습니다. 이러한 오류는 또한 인내 또는 회귀 오류로 분류됩니다. 쥐가 이전 작업에서 이전 규칙을 계속 따를 때 인내 오류가 커밋됩니다. 회귀 오류는 이전 규칙에서 해제되었지만 새 규칙을 계속 획득하려고 시도한 후에 커밋됩니다(이러한 유형의 오류의 계산 방법에 대한 자세한 내용은 게시된메서드(18)를참조).
- 쥐가 15 s 이내에 광 큐에 응답하지 않은 경우, 재판은 누락으로 분류되며, 기준에 대한 시험의 총 수에 포함되지 않습니다. 먼저 올바른 응답 수(데이터 파일의 배열 B의 두 번째 열에 위치) 및 오류 수(데이터 파일의 배열 B의 세 번째 열에 위치)를 함께 추가하여 계산합니다. 다음으로 이 숫자를 총 평가판 수에서 기준으로 뺍니다(이 숫자는 시험과 기준과 다른 데이터 파일의 배열 B의 첫 번째 열의 마지막 숫자입니다).
- 프로그램에 의해 기록된 시작 및 완료 시간을 사용(테스트 당일에 MED-PC 스크립트에서 생성된 데이터 파일의 맨 위에 위치)을 사용하여 기준 시간을 계산합니다. 첫 번째 레버 프레스에 대한 대기 시간은 또한 변수 K(제1 레버 프레스에서 초 단위로 경과시간)를 기준으로 하여 데이터 파일에서 계산할 수 있습니다.
- 동일한 치료 그룹 내의 쥐에 대한 각 행동 측정에 대한 데이터를 평균합니다. 적절한 통계 분석을 수행합니다(검사 중인 변수 수에 따라 다름).
8. 뇌 기판
- 관심 있는 뇌 영역 및 인지 유연성의 측면을 결정합니다. 예를 들어, 스트레스가 측면 반전 작업에서 인내 오류를 증가시키는 경우, 이전 병변 연구에서 이 뇌 영역이 여러 형태의 반전 학습(즉, 사이드 반전 작업에서 테스트된 공간반전)에서역할을 한다는 것을 지적했기 때문에, 오비토프탈 피질(OFC)은 특히 흥미로울 수있다. 이 예에서, 전략 이동 패러다임 후 희생 쥐를 희생하고 설명된 면역히스토컬방법을 사용하여 OFC에서 c-fos(신경 활성화37의척도)를 검사하고 여기서 간략하게 설명하였다.
- 첫째, 동물에서 뇌를 추출하고 40 μm 슬라이스로 잘라.
- 인산염 완충식식염수(PBS)에서 각각 5분 동안 4배씩 티슈를 세척한 다음, 내인성 과산화효소를 담금질하기 위해 10분 동안 과산화수소 0.3%로 배양합니다.
- PBS2x에서 각각 5분 동안 세척한 다음 마우스 안티-c-fos 1차 항체(1:500), 3% 정상 당나귀 혈청(NDS), 트리톤 X0.3% 내무를 심야 에 배양한다.
- 다음 날, PBS3x에서 각각 5분 동안 3배씩 세척한 다음, 비오틴-SP-컨쥬게이드 당나귀 항마우스 염리 항체(1:500)에서 2시간 동안 배양한다.
- PBS에서 조직을 각각 5분 동안 3배 씩 세척한 다음 아비딘 스트렙타비딘 AB 콤플렉스에서 1시간 동안 배양합니다.
- PBS에서 조직을 각각 5분 동안 3배 씩 세척한 다음, 조직이 산화 염색체 반응을 거치면서 최대 10분 동안 DAB 용액으로 배양합니다.
- PBS에서 조직을 각각 5분 동안 3배 세척한 다음 유리 현미경 슬라이드에 뇌 조각을 장착합니다.
- 밝은 필드 현미경을 사용하여 톨루엔 기반 마운팅 매체 및 이미지를 사용하여 조직을 커버 슬립.
참고: 대표 결과에 반영된 바와 같이, 쥐는 패러다임이 끝난 후 30분, 반전 작업이 완료된 후 약 60~90분(라이트 태스크에서 각 쥐의 성능에 따라 다름)을 희생한다. 이는 반전 작업의 성능을 반영하는 c-fos 식38에대한 최적의 타이밍을 나타내야 합니다.
- 대안적으로, 스트레스 또는 패러다임을 이동 하는 작동 전략의 실행 전에 약물 주사 또는 바이러스 주사에 대 한 특정 뇌 영역을 수 있습니다.
참고: 연구원은 신경 기판을 조작하는 것이 인지 유연성에 대한 스트레스의 영향을 어떻게 변화시키는지 조사할 수 있습니다. 예를 들면, 연구원은 시험하기 전에 전두엽 피질에 있는 특정 신경 전달 물질 수용체를 막을 수 있습니다.
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Representative Results
위에서 설명한 적응된 자동 작동 전략 이동 패러다임은 반복되는 구속 스트레스가 남성과 여성 스프라그 Dawley 쥐의 인식에 영향을 미치는지 여부를 결정하는 데 사용되었습니다. 대표 행동 데이터는 아래 그림 2에 설명되어 있습니다. 요컨대, 제어 및 반복적으로 절제 된 쥐는 측면 차별, 측면 반전 및 가벼운 차별과 같은 일련의 작업으로 구성된이 작동 전략 이동 테스트를 수행했습니다.
각 작업에 대한 기준에 대한 평가판은 그림 2A에묘사됩니다. 일반적으로 각 작업에서 더 나은 성능은 기준에 대한 시험 횟수가 줄어든 것으로 표현되었습니다. 이 데이터는, 급성 구속에 따라, 남성은 스트레스보다 훨씬 적은 시험에서 측면 반전 작업을 완료 것을 나타냅니다, 제어 남성. 반대로, 스트레스를 받은 여성은 측면 반전 작업을 완료하기 위해 훨씬 더 많은 수의 시험이 필요했습니다. 이러한 결과 남성 스트레스 다음 향상 된 성능을 전시 제안, 반면 여성 성능 저하 를 전시. 가벼운 차별 작업에서, 스트레스는 여성을 통제하는 것에 비해 기준으로 시험의 수를 증가시켰고, 이로 인해 여성의 성능이 저하되었지만 이 과제에서는 남성이 아닙니다.
각 주의 작업에 대해 수행되는 총 오류 수는 그림 2B에표시됩니다. 기준에 재판의 수와 일치, 스트레스 남성은 제어 남성보다 훨씬 적은 오류를 만든 반면, 스트레스 여성은 측면 반전 작업에 더 많은 오류를 했다. 또한, 가벼운 차별 작업에서, 여성은 또한 훨씬 더 많은 오류를 했다. 요약하자면, 이러한 데이터는 반복된 스트레스가 남성의 인지 성능을 향상하지만 여성의 인지 성능을 저하시킨다는 것을 시사합니다.
총 오차는 도 2C에서 인내 또는 회귀 오류로 더 분류되었습니다(이러한 두 가지 유형의 오류 간의 구별은 프로토콜의 섹션 7을 참조). 흥미롭게도, 스트레스 남성 제어 남성 보다 측면 반전 작업에 적은 인내 오류를 했다. 반면, 측면 반전과 가벼운 차별 작업 모두에서, 강조 여성은 제어 여성보다 인내 오류의 큰 숫자를했다. 어느 작업 도중 이루어진 회귀 오류의 수에 있는 처리 단 사이 아무 차이가 없었습니다.
각 시험 및 기준에 도달하는 시간의 누락은 그림 2D에 표시됩니다(이 것들이 계산된 방법에 대한 자세한 내용은 프로토콜의 섹션 7을 참조함). 이러한 조치는 이 작업이 가장 큰 성차이를 나타내면서 측면 반전 작업에서만 평가되었습니다. 스트레스여성들은 다른 모든 치료집단에 비해 더 높은 입원율을 보였습니다. 또한, 스트레스는 남성의 측면 반전 작업을 완료하는 시간을 감소하는 것으로 나타났다 동안, 스트레스는 여성의 작업의 장기간 완료. 요약하자면, 반복되는 스트레스는 남성의 인지 유연성을 손상시키지만 남성은 그렇지 않습니다.
인지 유연성의 기본 뇌 기판은 그림 3에묘사됩니다. 측면 반전 작업에서 뚜렷한 성차가 관찰됨에 따라 이 작업의 기본 뇌 영역을 검사하여 신경 활동에 유사한 성차이를 표시했는지 여부를 결정했습니다. 앞서 논의된 바와 같이, 병변 연구는 궤도 피질(OFC)이 측 반전태스크(34)를중재한다는 것을 나타냈다. 따라서, c-fos, 신경 활성화(37)의측정은, 측면 반전 작업(38)에서성능을 반영해야 전략 이동의 완료 후 30 분 OFC에 표시되었다. 그러나 OFC가 이태스크(39)의초차원 전략 이동 구성 요소에 역할을 할 수도 있다. 따라서, 패러다임을 이동하는 조작 전략 내에서 특정 작업 중에 뇌 활동을 반영하기 위해 적절한 시간에 희생을 수행하는 것이 중요하다. 여기서, 스트레스는 대조군에 비해 남성의 OFC에서 뉴런 활성화에 상당한 증가를유도. 그러나, 스트레스는 대조군에 비해 여성의 OFC에 있는 신경 활성화에 있는 유의한 감소를 유도했습니다. 또한, 남성에서, OFC 활성화 및 기준에 대한 시험은 부정적으로 상관 관계가 있었다; 특히, OFC 활성화가 높을수록 기준이 적은 시험과 관련이 있었습니다. 대조적으로, OFC 활성화와 여성의 성능 사이에는 상관 관계가 없었으며, 이러한 공연 중에 OFC가 해체되었다는 것을 시사했습니다.
그림 1: 훈련 및 테스트 일 동안 패러다임을 이동하는 작동 전략의 회로도.
그림 2: 패러다임을 이동하는 조작 전략의 대표적인 행동 데이터입니다. (A) 시험 당일 각 과제에 대한 기준을 시험합니다. 사이드 반전 작업에서, 스트레스는 남성의 성능을 향상하지만 여성의 성능이 손상되었습니다. 가벼운 차별 과제에서 스트레스는 여성의 성능을 약화시켰지만 남성에는 영향을 미치지 않았습니다. (B) 테스트 당일 각 작업에 대한 오류 수입니다. 스트레스는 남성에서 발생하는 오류의 수를 감소시켰지만 측면 반전과 가벼운 차별 작업 모두에서 여성의 오류가 증가했습니다. (C) 인내 및 회귀 오류 분류. 스트레스는 남성에서 인내 오류를 감소하지만 측면 반전과 가벼운 차별 작업 모두에서 여성에서 만든 인내 오류가 증가. (D) 백분율 시험생략 및 측면 반전 작업에서 기준시간. 스트레스는 여성 쥐에 있는 백분율 누락을 증가했습니다. 스트레스는 남성에 의해 필요한 시간을 감소하지만 작업을 완료하는 여성에 의해 필요한 시간을 증가. 통계는 양방향 ANOVA를 사용하여 계산되었으며 Tukey의 t-test(그룹당 12마리의 쥐; 오류 막대는 SEM을 나타내며, #p ≤ 0.10, *p < 0.05). 이 그림은 이전 간행물17에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 패러다임을 이동하는 조작 전략 후 대표적인 신경 활성화. (A) 전략 이동 작업 후 OFC 활성화. 면역히스토케미칼 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)의 대표적인 이미지는 밝은 필드 현미경을 사용하여 시각화된 OFC에서 c-fos에 대한 항체를 이용한 염색한 다음 정량화하였다. 스트레스는 크게 증가 활성화 (c-fos 표현 세포의 수에 의해 입증) 남성의 OFC에서, 그것은 여성의 활성화를 감소하는 동안. 오른쪽 아래 이미지 패널의 배율 막대는 200 μm을 나타냅니다. 통계는 양방향 ANOVA를 사용하여 계산되었으며 Tukey의 t-test(그룹당 12마리, 쥐당 OFC의 6-8개 섹션, 오류 막대는 SEM을 나타내며 * p < 0.05). (B) OFC 활성화와 상관관계가 있는 측면 반전 작업에서 기준을 시험한다. 남성은 상당한 부정적인 상관 관계를 표시, 반면 여성은하지 않았다.
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Discussion
프로토콜인지 기능에 스트레스의 영향을 측정 하는 방법을 보여줍니다. 특히, 패러다임을 이동하는 수정된 조작 전략은 설치류에 사용되며, 이는 인지 유연성을 측정하는 데 사용됩니다(인간의 위스콘신 카드 정렬 작업과 유사)1. 인지 유연성은 환경에서 새로운 조건에 직면하기 위해 인지 처리 전략을 적응시키는 기능을 나타내며 정상적인 일일 기능2에매우 중요합니다. 인지 유연성에 대한 인간의 연구는 주로 뇌 이미징11에국한되기 때문에 동물에서이 패러다임의 사용은 뇌와 인지에 대한 스트레스의 영향에 대한 이해를 크게 향상시킬 것입니다.
스트레스는 인지 기능(40)을손상시킬 수 있습니다. 사실, 이것은 PTSD 와 MDD3,41과같은 스트레스 관련 질병에서 가장 흔한 표현형 중 하나입니다. 더욱이, 스트레스 관련 정신질환의 발생에 극단적인 성차가 있다5,6,7,아직 이러한 편향된 발생률 뒤에 신경생물학의 이해가 거의 없다. 따라서 남녀 모두의 동물에서 패러다임을 이동하는이 작동 전략의 사용은 정신과에서 성 차이의 현재 이해를 발전시키는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 작동 가능한 전략 이동 작업을 통해 연구자들은 정신 장애와 관련된 인식의 주요 측면을 검사할 수 있습니다. 예를 들어 실험 조작 후인내오류가 이 패러다임에서 계산됩니다. 인내는 PTSD와 같은 스트레스 관련 정신 질환에서 관찰되며, 새로운 규칙 세트를 배우는 능력을 손상시키며 궁극적으로 작업 메모리3을손상시합니다. 따라서 인내 오류의 측정은 번역적으로 관련이 있습니다. 더욱이, 주의 작업에 누락은 PTSD를 가진 환자에서 지적되었습니다, 느린 피질 처리3을나타내는. 따라서, 이러한 패러다임에서 누락 된 데이터는 임상 대응이있을 수 있습니다. 요약하자면, 이 실험적인 패러다임모델에 의해 측정된 인지 유연성은 정신 장애에서 관찰되는 주요 표현형을 모델합니다.
이 실험 패러다임은 또한 인지 유연성의 근본적인 신경 기판을 표적으로 하는 정밀성을 허용합니다. 예를 들어, 문헌은 전두엽 피질(PFC)이 내측 전두엽(mPFC) 및 궤도 피질(OFC)을 포함하여 인지 유연성3에대한 중요한 뇌 영역임을 나타냈다. PFC의 이러한 하위 영역 중 OFC는 측면 반전태스크(34)및35에서의 성능에 중요합니다. 이러한 뇌 영역은 또한 스트레스 유발 기능변경에대 한 주요 대상42,43. 흥미롭게도, 여기에 사용되는 스트레스의 모델은 인지 유연성의 테스트에서 설치류의 후속 성능에 역할을하는 것으로 보인다; 따라서 향후 실험의 설계에서 고려해야 합니다. 스트레스에 대한 이러한 다양한 반응은 인식이 스트레스에 의해 영향을받는 잠재적으로 새로운 메커니즘을 가리킵니다. 따라서, 특정 신경 전달 물질을 대상으로, 단백질, 또는 이러한 뇌 영역의 활성화 스트레스 남성과 여성 설치류에서 인식에 미치는 영향에 빛을 발산 수 있습니다. 연구원은 스트레스 또는 전략 이동과 함께 다른 시점에서 이러한 신경 기판을 조작하거나 이러한 행동 패러다임에 노출 된 후 신경 기판을 측정 할 수 있습니다.
이 수정된 작동 전략 이동 작업은 스트레스 문헌(즉, 굴착작업12,13,14,15)에사용되는 다른 인지 유연성 패러다임에 비해 명확한 이점이 있으며, 이는 설치류를 훈련시키기 위해 실험자가 더 많은 시간과 노력을 필요로 합니다. 이 절차는 실험자의 최소한의 감독이 필요하며 여러 쥐를 동시에 테스트할 수 있습니다. 또한 이 자동화 된 작업(19)의다른 버전과 달리 패러다임은 3 일의 교육만 필요하며 효율적인 프로그래밍 된 데이터 분석을 포함합니다.
패러다임을 이동하는 운용 전략에는 특정 제한이 있습니다. 한 가지 제한은 두 개의 자극 치수(예: 좌우 레버 대 라이트 큐)만 테스트할 수 있는 반면, 파고작업(12,13,14,15)은 제3 자극 치수(예: 파기 미디어 대 악취 대 텍스처)를 테스트할 수 있다는 것입니다. 그러나 이 프로토콜에 설명된 작업은 여전히 다른 규칙으로 이동하는 쥐의 능력을 테스트할 수 있게 해주며, 이는 인지 유연성 구조의 테스트를 허용합니다. 또한, 제3자극(예를 들어, 악취)을 허용하기 위해 조작 챔버에 다른 파라미터를 추가할 수 있지만, 이는 작업에 필요한 훈련을 연장할 수 있다.
이 작업의 주요 장점은 스트레스또는 약리학적 조작과 결합하여 스트레스가 뇌에 미치는 영향을 더 잘 이해할 수 있는 단순성과 능력입니다. 이 단순성은 생태학적으로 관련된 굴착 작업에 비해, 레버 프레스를 배우는 동안 피사체가 직면 증가 어려움과 함께 온다는 점에 유의해야한다. 이 작동 작업은 노동 집약적일 수 있지만 설치류는 일반적으로 이 작업을 획득하기 위해 더 많은 시험이 필요합니다. 그러나, 파고 작업과 이 패러다임 모두 유사한 신경 생물학적 메커니즘을 관여시키고 따라서 인지유연성(16,44)의검사를 위한 유효한선택권을나타낸다. 발굴 작업을 이용하여 인지 유연성에 대한 스트레스의 영향에 관한 문헌에서 다양한 결과가 있었지만, 이러한 작동절차(23,25,27,45,46)는,제시된 방법은 스트레스의 유형, 강도 및 지속시간이 인지기능(20,21)에가질 수 있는 복잡한 효과를 반영한다.
작업의 또 다른 제한은 설치류가 닫힌 불투명 상자에 보관된다는 것입니다. 따라서 컴퓨터 인터페이스를 통해 수집되는 동작 이외의 동작은 코딩할 수 없습니다. 예를 들어, 쥐에 의한 많은 누락은 스트레스에 의해 가해지는 행동 억제 때문일 수 있거나 쥐가 잠들기 때문일 수 있다. 또한 그루밍(스트레스 공부에 특히 관련이 있음)과 같은 다른 고정관적인 동작은 작업 중에 분석하는 것이 재미있을 수 있습니다. 작동 챔버에 카메라를 장착하면 이러한 유형의 행동 정밀도가 허용될 수 있습니다.
전반적으로,이 보고서는 스트레스가 뇌에 미치는 영향을 더 이해하기 위해 패러다임을 이동하는 작동 전략과 함께 스트레스 절차의 사용을 자세히 설명합니다. 그것은 주목해야한다, 성인의 스트레스 절차와 인지 평가 뿐만 아니라, 다른 발달 단계에 대한 연구는 인지 유연성의 병인에 대한 중요한 정보를 제공 할 수 있습니다. 스트레스가 인지 유연성에 미치는 영향을 연구하는 것 외에도 패러다임을 이동하는 이 간단하고 효율적인 조작 전략은 뇌가 변화하는 환경에 어떻게 적응하는지 조사하기 위해 많은 실험 적 조작과 결합 될 수 있습니다. 더욱이, 대체 실험 접근법은 병변, 약리학, 유전자 편집 및 전기 생리학을 포함하여 인지 유연성의 신경 기초를 연구하기 위하여 이용될 수 있습니다. 인지 유연성은 정신 질환의 주요 표현형 중 하나이기 때문에 신경 생물학적 기판을 더 이해하기 위해 더 많은 연구가 수행되어야합니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 그라페 실험실에서 패러다임을 이동하는이 오페라 전략을 수립하는 데 도움을 준 한나 자모어, 에밀리 삭스, 조쉬 시얼에게 감사드립니다. 그들은 또한 분석을 위한 MATLAB 코드에 대한 그의 도움에 대해 케빈 스나이더에게 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 inch glass pipette eye droppers | Amazon | 4306-30-012LC | For vaginal lavage |
| Alcohol Wipes | VWR | 15648-990 | To clean trays in set shifting boxes between rats |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse lgG (H+L), minimal cross reaction to bovine, chicken, goat, guinea pig, hamster, horse, human, rabbit, sheep serum proteins | Jackson ImmunoResearch | 715-065-150 | All other DAB protocol staining materials are standard buffers/DAB and are not specified here, as this is not the main focus of the methods paper |
| C-fos mouse monoclonal primary antibody | AbCam | ab208942 | To stain neural activation in brain areas after set shifting |
| Dustless Food Pellets | Bio Serv | F0021 | For set shifting boxes (dispenser for reward) |
| GraphPad Prism | Used for data analysis | ||
| Leica DM4 B Microscope and associated imaging software | Leica | Lots of different parts for the microscope and work station, for imaging lavage and/or cfos | |
| MatLab | Software; code to help analyze set shifting data, available upon request. | ||
| Med-PC Software Suite | Med Associates | SOF-736 | Software; uses codes to operate operant chambers |
| Operant Chambers | Med PC | MED-008-B2 | Many different parts for the chamber set up and software to work with it; we also wrote a separate code for set shifting, available upon request. |
| Rat Bedding | Envigo | T.7097 | |
| Rat Chow | Envigo | T.2014.15 | |
| Restraint Devices | Bryn Mawr College | Made by our shop | For stress exposure; specifications available upon request. |
| Scribbles 3d fabric paint | Amazon | 54139 | For vaginal lavage |
| Sprague Dawley Rats | Envigo | At least D65 Males and Females | |
| VWR Superfrost Plus Micro Slide | VWR | 48311-703 | For vaginal lavage and/or brain slices/staining for c-fos |
References
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