Summary
ストレスの多い生命事象は認知機能を損ない、精神疾患のリスクを高める。このプロトコルは、男性と女性のスプレイグ・ドーリーラットのパラダイムをシフトする自動化されたオペラ戦略を使用して、ストレスが認知の柔軟性にどのような影響を与えるかを示しています。特定の行動の根底にある特定の脳領域について議論し、結果の翻訳関連性を探求する。
Abstract
ストレスは認知機能に影響を与えます。ストレスが認知機能を高めるか損なうかは、1)タイプ、強度、ストレータの持続時間を含むいくつかの要因に依存します。2)研究中の認知機能の種類;そして3)認知タスクの学習または実行に関連するストレータのタイミング。さらに、ストレスが認知機能に及ぼす影響の性差が広く文書化されている。ここでは、ストレスの変動が男性と女性のスプレイグ・ドーリーラットの認知柔軟性にどのような影響を与えるかを評価するための自動化されたオペラ戦略シフトパラダイムの適応です。具体的には、拘束ストレスは、ストレスが男女の認知能力にどのような影響を与えるかを調べるために、このオペラベースのタスクのトレーニングの前後に使用されます。この自動化されたパラダイムにおける各タスクに関連する特定の脳領域は、十分に確立されている(すなわち、内側前頭前野および眼窩前頭皮質)。これにより、パラダイムの完了時に、実験中の標的操作や、これらの領域の特定の遺伝子およびタンパク質の評価が可能になります。このパラダイムは、ストレスの後に発生するさまざまなタイプのパフォーマンスエラーを検出することを可能にし、それぞれが神経基質を定義しています。また、繰り返し拘束ストレスパラダイムの後の忍耐エラーにおける明確な性差も同定される。前臨床モデルでこれらの技術を使用すると、ストレスが脳にどのような影響を与え、心的外傷後ストレス障害(PTSD)や大うつ病性障害(MDD)などの精神疾患の認知を損なう可能性があります。
Introduction
人間では、ストレスの多いライフイベントは、認知機能(すなわち、認知の柔軟性1)を損なう可能性があり、これは認知処理戦略を環境の新しい条件に直面するように適応する能力を意味する2。認知障害は、心的外傷後ストレス障害(PTSD)および大うつ病障害(MDD)3,4などの多くの精神疾患を引き起こし、悪化させる。これらの疾患は女性5、6、7、8の2倍の流行であるが、この格差の生物学的根拠は不明のままである。人間のエグゼクティブ機能の側面は、ウィスコンシンカードソーティングタスク、認知柔軟性のデモンストレーション2を使用して評価することができます。このタスクにおけるパフォーマンスは、PTSD9およびMDD10を有する患者において損なわれるが、この変化の神経基盤は脳イメージング11によってしか調べることができない。
ストレスが脳にどのような影響を与えるかを理解する上での進歩は、動物モデル、特にげっ歯類の使用を通じて行われてきた。認知の柔軟性はストレス関連疾患に影響を受けるので、げっ歯類を調べるのは非常に関連性の高い表現型です。現在までに、ほとんどのストレス神経生物学の文献は、代替認知柔軟性パラダイム(掘り出し作業とも呼ばれます)12、13、14、15を使用しています。このタスクは広範囲に検証されていますが、げっ歯類を訓練するには実験者によってより多くの時間と労力が必要です。適応し、ここで説明は、様々なストレスモデル17、18を使用して男性と女性のスプレイグドーレーラットの認知の柔軟性を評価するために確立された自動セットシフトプロトコル16です。この手順は、実験者による最小限の監視を必要とし、複数のラットを同時にテストすることができます。さらに、この自動化されたタスク19の他のバージョンとは異なり、このパラダイムの適応は3日間のトレーニングを必要とし、効率的なプログラムされたデータ分析を含みます。
ストレスが認知機能を増強するか、または損なうかは、ストレータの種類、強度、および持続時間、ならびに認知タスク20,21の学習または実行に関連するストレータのタイミングに依存する。したがって、プロトコルは、オペラントトレーニングの前後の両方のストレス手順を組み込んでいます。また、ストレス研究の代表的な結果を調べます。また、セットシフトの特定の側面の基礎となる脳領域は、2、16、22を確立されています。したがって、この報告書はまた、ストレスおよび戦略シフト手順の間または後に特定の脳領域を標的にして評価する方法を説明する。
認知の柔軟性の性差を直接調べる研究は限られています18,23. プロトコルは、1)実験的パラダイムに男性と女性の両方のラットを組み込む方法を説明し、その後2)自由にサイクリング女性の手順の前後にエストルースサイクルを追跡する。以前の研究では、オペラントトレーニング前のストレスは、ラット17の認知柔軟性における性特異的な欠陥につながる可能性があることを示している。特に、雌ラットはストレス後の認知の柔軟性に混乱を示し、一方、認知の柔軟性はストレス17後の雄ラットで改善する。興味深いことに、ヒトの性に偏った発生率を有するストレス関連精神疾患の主な特徴は、認知的柔軟性の不足である。これらの結果は、女性が男性よりもこのタイプの認知障害に対してより脆弱である可能性があることを示唆している。動物モデルにおけるこれらの技術の使用は、脳に対するストレスの影響と、それがヒトの精神疾患における認知を損なう方法に光を当てる。
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Protocol
この研究のすべての手順は、ブリン・マウア・カレッジの制度的動物ケアと使用委員会(IACUC)によって承認されました。実験動物を注文し、実験を開始する前に、IACUCまたはそれ以外の適用される規制の承認を得る。
1. 動物の準備
- 男性と女性の大人のスプレイグ・ドーリーラットを取得します。
注:ラットは65日前に出産することができますが、男性と女性の両方が完全に成熟していることを確認するために、この時点まで手順を開始しないでください。 - ペアハウスの同性ラットはできるだけ長く、長期的な隔離がストスタク24であるとして。食品制限のために、オペラ戦略シフトプロトコルの直前にネズミを歌う。
- 1週間の順応の後、1日3~5分間ラットの取り扱いをやさしく始めます。各ラットの体重を収集します。さらに、性腺ホルモンが結果にどのような影響を与えるかを評価することに興味がある場合は、雌ラットの膣洗浄を収集する(セクション2に記載)。
- 訓練開始の少なくとも3日前にパラダイムをシフトするオペラ戦略で実行される動物を(食べ物から)制限して、タスクを正常に学ぶようにします。水が常に自由に利用できることを確認してください。各動物の記録は、毎日の食物および流体の消費、水分補給の状態、およびプロトコルから動物を一時的または永久的に除去するための基準として使用される行動および臨床的変化を文書化するために維持されるべきである(Morton 2000;NRC 2003b)。
- トレーニング前に3日以上ストレス手順を採用する場合、ストレスの日数(例えば、5日間の拘束と食品制限25)に一致するように食品制限を調整する。
- 毎日、通常の1日の食物摂取量の80%を送達する(すなわち、体重100g当たり4gの食物)26。ラットの毎日の体重コレクションを使用して、毎日与える食べ物の量を計算します。
- トレーニングとテストの日を通して、食品の制限を続けます。しかし、ラットが一日のトレーニングやテストを完了するまで、家庭のケージに食べ物を入れないでください。これは、オペランチャンバーで実行するモチベーションの低下を避けるのに役立ちます(その後、単にホームケージで食べ物を待つことを支持するので)、タスクの完了時にラットへの食物配達のタイミングはかなり予測不可能であることを確認してください。
注:拘束ストレスパラダイムを受けている動物は、コントロール、ストレスのない被験者よりも有意に大きな減量を示していません。しかし、様々なストレス手順自体が体重減少を誘発し、体重ベースの食品制限中にストレスを受けていないラットよりも少ない食物を受け取る。これは、追加の、交感ストリファを提示することができます。そうであるように思われる場合は、体重27に関係なく、各被験者に与えられる一定量の食品を代わりに使用する。
2. 膣洗浄
注:性腺ホルモン(すなわち、エストロゲンとプロゲステロン)は、ストレス応答と認知28、29、30に影響を与えることが知られている。これらのホルモンは雌ラット31のエストルスサイクルで変動する。ストレスや認知の柔軟性データと相関するように自由にサイクリング女性げっ歯類のエストルースサイクルを追跡することに興味がある場合は、以下に説明するように膣洗浄を収集します。エストルースサイクルステージを考慮した代表的なデータは提供されていない。
- 女性から膣洗浄サンプルを取得するには、きれいなビーカー、ガラススポイト、"ラベジ"スライド(ラベラーサンプルを保持するアクリル塗料サークル付きの顕微鏡スライド)、および1つの空のビーカーに温水を収集します。
- 少量のぬるま湯(0.5mL)でスポイトを満たし、その後、(その尾で持ち上げることによって)雌のラットの膣に先端を挿入します。滅菌水を2x-3xを排出し、採取した流体を顕微鏡スライドに排出します。ラヴィージスライドの円をオーバーフローしないでください。
- 余分な液体を空のビーカーに排出します。ラベジスライドにラット番号のラベルを付け、各ラットのサンプルをその順序で入れて、どのサンプルが各ラットに属しているかを明確にします。
- きれいなぬるま湯をピペット化し、それを「過剰」ビーカーに数回分配してから、次のラットをサンプリングするためにスポイトを充填する前に、スポイトを徹底的に洗い流します。
- 慎重にラベジのスライドを明視野顕微鏡に運び、洗浄サンプルをイメージし、Beckerら31で説明したように、エストルースサイクル内で一日を分類する。
注:理想的には、ラベラーは、女性のサイクルを適切に追跡するために数週間行われるべきであり、概日リズムを制御するために毎日非常に類似した時間に行われるべきです。好ましくは、この手順は、ストレスおよびオペラ戦略シフト手順の前に実行する必要があります。綿棒および生殖不能生理液の使用はまたこのスポイトの技術の代替として使用することができる。雌ラットのデータは、エコストリスサイクル日(ストレスが行われるサイクルの日やテストが発生した場合のサイクルの日を考慮)に従って、ポストホックで分析することができます。
3. 機器とソフトウェア
- 行動訓練およびテストのためのオペラ室を使用してください。
- チャンバーには、上記の2つの刺激ライト、ハウスライト、およびこれらのタスクのための補強用ディスペンサーを備えた少なくとも2つの格納式レバーが含まれていることを確認してください。
- レバーが中央補強供給エリアの両側にあり、各レバーの上に1つの刺激光が付いていることを確認します。
- ハウスライトを使用して、光刺激の検出を妨げることなくチャンバーを照らします(ハウスライトがチャンバーの裏壁にあり、レバーや刺激ライトの反対側にある場合に最適です)。
- 食品制限ラットの強化には、ダストレス食品ペレット(ここでは45mgペレットが使用されます:18.7%タンパク質、5.6%脂肪、4.7%繊維)を使用してください。ショ糖や脂肪の多いペレットを使用しないでください(ストレスが味わい可能な食物摂取に与える影響に関心がない限り)。
- チャンバーを操作できるソフトウェアを使用して、コンピュータからの刺激、レバー操作、およびデータ収集の表示を制御する(材料表)。
注:このソフトウェアを使用したプログラムのコーディングに関連する情報については、作者にお問い合わせください。MED-PC スクリプトは補助ファイルとして含まれています。このソフトウェアは、各試行に対する動物の反応(どのレバーが押されているか、それが正しい/間違っているか、応答がないか、および選択を行うための待ち時間)に関する情報を収集します。この情報から、ユーザーは行動分析セクションで説明されているように、行動パラダイムのさまざまなメジャーを計算できます。 - ストレスホルモン32( およびその他の関連する措置)の概日リズムを制御するために、毎日同じ時間にトレーニング/テストを行います。
- 各操作箱の底トレイに新鮮な寝具を入れ、便を回収します。各セッションに続いて、各トレイ、清潔なトレイ、チャンバーインテリアをアルコール拭きまたはIACUC承認消毒剤でダンプし、チャンバーに新しい動物を置く前に新鮮な寝具に交換してください。
4. ストレス手順
- ストレス手順を、オペラ戦略シフトパラダイム(例えば、3日間のオペラ訓練前の5日間の拘束ストレスと3日間の手術訓練 の 前に、単一の拘束とテスト)に関する訓練の前、中、および/または訓練後に行うべきかどうかを決定します。
- オペラ訓練に関して、毎日同時にストレス手順を実行します。(例えば、9 A.Mから始まる拘束応力の30分、続いてオペラ室への配置)。
- コロニールームと戦略シフトパラダイムルームの両方から別の部屋でストレス手順を実行する(目撃者のストレスに関連する交感要因がないことを確認する)33.簡単に言えば、ラットをブルームスタイルの透明な拘束チューブに入れ、手足や尾をつままないように注意して開口部を密封します。各被験者の間で、ブルームスタイルのチューブをきれいにするためにIACUC承認消毒剤を使用してください。不適切な消毒は、テストプロトコルに悪影響を及ぼす可能性のあるフェロモンを後ろに残すことができます。
注:ラットの最初のグループがオペラ室で過ごす期間を見積もります。これはトレーニング と テストの日によって異なります。ただし、複数のコホートを実行した後、各タスクを完了して将来のタスクを見積もる平均時間を計算できます。 - 利用可能な室の数に応じて、被験者のストレス手順をずらします。例えば、4匹のラットは拘束応力を受け、4つの手術室に入れられる。1時間後、さらに4匹の動物がオペラ座に続くストレス処置を受ける。
5. トレーニング
注:このパラダイムは、Florescoらによって開発されたオペラのセットシフト手順から変更され、3日間で完了することができます。 ラットのトレーニング手順は3日(以下に説明するように各タスクを学習するのに1日)を必要とします。ラットがこれらのタスクを学ばないことはまれです。ラットが各タスクを学習できない場合は、最終調査から除外する必要があります。以下に説明するトレーニングパラダイムの視覚的な描写については、 図1A を参照してください。
- チャンバーにラットを入れる前に、ディスペンサーに十分な食品ペレットがあり、オペランボックスが適切に機能していることを確認してください。これを達成するために、空の部屋でトレーニングまたはテストデイプログラムをロードして開始し、正しいレバーがレバープレスごとに1つの報酬を適切に提供することを手動でテストします。
- 各レバーを押すラットを訓練する
- トレーニングの最初の日のために箱にラットを置く前に、各部屋の中の訓練手順をロードする際に指定された正しいレバーに手動で1つの食糧ペレット報酬を設定する。
- 各正しいレバープレスが1つの補強で報われるような固定比率(FR-1)スケジュールを使用してラットを訓練します。チャンバーを操作するコンピュータにトレーニング手順をロードする際に正しいレバーを指定することで、被験者や実験条件(一度に1つのレバーのみ整形)で1日あたりの正しいレバーのバランスを取ります。
- 正しいレバーを50x押して基準に達するまでラットがレバーを押し、通常は30~45分の間に作業を完了します。
- 翌日、ラットはトレーニングの最初の日と同じプログラムを使用して反対側のレバーでこのタスクを実行するように強制しますが、反対側のレバーを正しいものとして指定します。トレーニングのこの日に食品ペレットでレバーを「形作る」必要はありません。通常、この基準は、ラットが最初のレバーを押すことを学んだ後にすぐに取得されます。
- ライトキューに応答するラットのトレーニング
- 訓練の3日目に、ラットが潜在的に食品ペレット報酬を受け取るためにレバーの1つを押す可能性がある15の試験のために両方のレバーの上の光を照らします。軽い差別作業の間、このプログラムは試行によって正しいレバーをランダムに選択します。
- ラットが正しいレバーを押した場合は、ライトが3 sで点灯したままで、報酬が届けられ、その後に5s期間が経過し、次のトライアルの前にライトが消灯されることを確認します。ネズミが誤ったレバーを押した場合は、報酬が届かないことと、次のトライアルの前に10 sのライトが消灯していることを確認してください。
- トレーニングのこの最後の日に続いて、ラットがレバープレスの合計数で割って1つのレバーのプレスの数を割ることによって、左または右のレバーの好みを持っているかどうかを判断するために「サイドバイアス」を計算します。テスト日には、ラットは、好ましいレバーに応答するのではなく、特定の応答報酬の不測の事態を学習していることを確認するために、最も好ましくない側から始まります。
6. テスト
注: 下記のテストパラダイムを視覚的に表現するには 、図1B を参照してください。
- 4日目(試験日)に、ストレス手順に従って手術室にラットを置き、横の差別、サイド逆転、および軽い差別タスクで連続的にテストします。光の識別タスクが「正しい」レバーの上のライトのみを照らしていることを確認します。各タスクでは、ラットは、報われない、誤ったレバーを押すことなく、各差別を完了するために連続して8つの正しい試験を達成する必要があります。間違ったレバープレスは、試験のこのチェーンをリセットします。
- 横の判別タスクを用いてラットを試験する。サイド差別プログラムを使用して、軽い手がかりに関係なく、トレーニングの3日目から決定された最も好ましくない側のレバーを押したラットに報酬を与えます。タスクは、正しいレバーを8x連続して押すと終了します(省略を除く)。
- サイド差別プログラムを使ってラットを再度走らせたりしてサイド反転試験を行うが、今度は側の判別タスクから正しいものと反対のレバーを正しいものとして指定する。ライトキューに関係なく、このレバーを押すことで、ラットが報われるようにします。タスクは、正しいレバーを8x連続して押すと終了します(省略を除く)。
- 上に照らされた光でレバーを押したネズミに報いる光判別作業を行います。各操作性試験は、正しいレバーを8倍連続で押すと完了します(省略を除く)。
注:以前の研究に基づいて、これらのタスクは、ラットが各タスク18のルールを学ぶのに十分な時間を持っていることを確認するために、連続したプレスに関係なく、最低30の試験をエンコードします。したがって、ラットが30回の試験が行われる前に8回の正しい試験を連続して達成した場合、タスクは30回の試験が完了するまで従事し続けます。
7. 行動分析
注: テスト日に動物ごとに取得したデータは、各タスクの MED-PC スクリプトが開始され、完了できる限り、コンピュータによって自動的に記録および保存されます (MED-PC スクリプトの補足資料を参照)。
- コンピュータプログラムを使用して、テスト日のタスク(サイド差別、サイド反転、光差別)のデータを開きます。プログラムによって記録された主なメジャーは、基準、基準の誤差、および基準までの時間に対する試行です。これらの措置について、以下で詳しく説明します。
注: 著者たちは、分析プロセスの自動化と、忍耐的なエラーと回帰的なエラーの分析を可能にするMATLABスクリプトを生成しました(データ分析を合理化するためのコード情報の著者に連絡してください)。- 試験を使用して、正確さの主な指標として、ラットが8つの正しい試験を連続して完了するために必要な試験の総数(省略を含まない)を基準にします。このデータは、配列 B の最初の列に、テスト日のタスクの MED-PC スクリプトによって生成されたデータ ファイルにあります。
- 各タスクの間に発生したエラーの合計を調べます。このデータは、テスト日のタスクの MED-PC スクリプトによって生成されたデータ ファイル内の配列 B の 3 番目の列にあります。これらのエラーは、忍耐的または回帰的なエラーにも分類されます。前のタスクの前のルールに従って、ラットが続行すると、エラーがコミットされます。回帰エラーは、前のルールから外れた後にコミットされますが、新しいルールの取得を続行します(これらのタイプのエラーの計算方法の詳細については、公開された方法18を参照してください)。
- ラットが15以内の軽い手がかりに反応しなかった場合、試験は省略として分類され、基準に試験の総数にカウントされません。これを計算するために、まず、正しい応答の数 (データ ファイルの配列 B の配列 B の 2 番目の列にあります) とエラーの数 (データ ファイルの配列 B の 3 列目に配置されます) を加算します。次に、この数値を試験の総数から基準に引きます (これは、データファイル内の配列 B の最初の列の最後の数値で、試行から基準に対する数値とは異なります)。
- プログラムによって記録された開始時刻と終了時刻 (テスト日のタスクの MED-PC スクリプトによって生成されたデータ ファイルの先頭にあります) を使用して、基準までの時間を計算します。最初のレバープレスに対する待ち時間は、基準までの時間から変数K(最初のレバープレスからの秒数)を差し引くことによってデータファイルから計算することもできます。
- 同じ治療群内のラットの行動測定ごとにデータを平均する。適切な統計分析を実行します(検査対象の変数の数に応じて異なります)。
8. 脳の基質
- 関心のある脳領域および/または認知の柔軟性の側面を決定します。.例えば、側逆転タスクにおける応力が忍耐誤差を増加させる場合、眼窩前頭皮質(OFC)は、この脳領域が多くの形態の逆転学習(すなわち、側逆転タスクでテストされた空間反転)34、35、36において役割を果たすことを示しているように、特に興味深い。この例では、戦略シフトパラダイムが完了した後にラットを犠牲にし、ここで説明した免疫物質化学的方法25を用いてOFCにおけるc-fos(神経活性化尺度37)を調べる。
- まず、動物から脳を抽出し、40μmのスライスに切ります。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS)4xで組織を5分間洗浄し、0.3%過酸化水素で10分間インキュベートし、内因性ペルオキシダーゼをクエンチします。
- PBS2xで組織をそれぞれ5分間洗浄し、マウス抗c-fos一次抗体(1:500)、3%正常ロバ血清(NDS)、および0.3%トリトンXを一晩インキュベートする。
- 翌日、PBS 3xで組織をそれぞれ5分間洗浄し、次にビオチンSP-コンジュゲートロバ抗マウスサリー抗体(1:500)で2時間インキュベートする。
- PBS3xで組織をそれぞれ5分間洗浄し、アビジン・ストレプトアビジンAB複合体中で1時間インキュベートする。
- PBS 3xで組織をそれぞれ5分間洗浄し、その後、組織が酸化発色反応を起ぜて最大10分間DAB溶液中でインキュベートする。
- PBS 3xで組織をそれぞれ5分間洗浄し、次に、ガラス顕微鏡スライドに脳スライスを取り付けます。
- 明視野顕微鏡を用いてトルエン系装着媒体と画像を用いて組織を覆い落とす。
注:ここでは、代表的な結果に反映されるように、ラットは戦略シフトパラダイムが終了した後30分、逆転タスクが完了した後に約60〜90分(軽いタスクにおける各ラットの性能に応じて)犠牲になります。これは、逆転タスクにおける性能を反映したc-fos式38の最適タイミングを表す必要がある。
- あるいは、ストレスの実行前に薬物注射またはウイルス注射のための特定の脳領域をカニューテレートするか、またはパラダイムを移すオペラ戦略。
注:研究者は、神経基質を操作すると、認知の柔軟性に対するストレスの影響がどのように変化するかを調べたいと思うかもしれません。例えば, 研究者は、テストの前頭前野の特定の神経伝達物質受容体をブロックすることができます。.
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Representative Results
上記で概説した適応された自動化されたオペラ戦略シフトパラダイムは、繰り返し拘束ストレスが男性および女性のスプレイグ・ドーリーラットの認知に影響を与えるかどうかを判断するために使用された。代表的な行動データは、以下の 図2 に記載されています。要するに、制御と繰り返し抑制されたラットは、一連のタスクで構成されたこのオペラ戦略シフトテストを行いました:サイド差別、サイド反転、光差別。
各タスクの基準を判断する試行は 、図 2Aに示されています。通常、各タスクのパフォーマンスが向上し、基準に対する試行回数が減少します。これらのデータは、急性拘束に続いて、男性がストレスを受けていないよりも有意に少ない試験で側逆転タスクを完了したことを示し、男性を制御する。逆に、ストレスを受けた女性は、サイドリバースタスクを完了するためにかなり多くの試験を必要としました。これらの結果は、男性がストレスに続いて改善されたパフォーマンスを示したのに対し、女性はパフォーマンス障害を示したことを示唆している。光の差別作業では、ストレスは対照女性に比べて基準に対する試験の数を増加させ、それによって女性のパフォーマンスを損なうが、このタスクでは男性では損なわれなかった。
各アテンション タスクに対して発生したエラーの総数を 図 2Bに示します。基準にする試験の数と一致して、ストレスを受けた男性は男性をコントロールするよりも有意に少ないエラーを犯したのに対し、ストレスを受けた女性は側の逆転タスクでより多くのエラーを犯した。さらに、軽い差別作業では、女性も大幅に多くの誤りを犯しました。要するに、これらのデータは、繰り返しストレスが男性の認知能力を向上させるが、女性の認知能力を損なうことを示唆している。
図 2Cでは、エラーの合計が、さらに、リサレーティブ エラーまたは回帰エラーに分類されました (これら 2 つのタイプのエラーを区別するために、プロトコルのセクション 7 を参照してください)。興味深いことに、ストレスを受けた男性は、男性をコントロールするよりもサイド反転タスクで忍耐的なエラーが少なくなりました。一方、サイド反転と軽い差別の両方のタスクで、ストレスを受けた女性は、コントロール女性よりも多くの忍耐的な誤りを犯しました。いずれのタスク中に発生した回帰的エラーの数にも、治療群の間に違いはありませんでした。
各試行の省略と基準に達するまでの時間を 図2D に示します(これらの計算方法の詳細については、プロトコルのセクション7を参照してください)。 これらの措置は、このタスクが最大の性差を示したので、側逆転タスクでのみ評価された。ストレスを受けた女性は、他のすべての治療群と比較して、省略の割合が高い。また、ストレスは男性の側逆転タスクを完了する時間を短縮するように見えたが、ストレスは女性のタスクの完了を延長した。要するに、繰り返しストレスは女性の認知の柔軟性を損なったが、男性は機能しない。
脳の基質の認知の柔軟性の基礎は 図 3に示されている。側逆転タスクで赤裸々な性差が観察されたので、このタスクの根底にある脳領域を調べて、神経活動に同様の性差を示しているかどうかを判断した。既に説明したように、病変研究は、眼窩前頭皮質(OFC)が側逆転タスク34を仲介することを示している。したがって、c-fosは、神経活性化37の尺度であり、戦略シフトの完了後30分でOFCにラベル付けされ、これはサイド反転タスク38に性能を反映しているはずである。しかし、OFCもこのタスク39の次元外戦略シフトコンポーネントに役割を果たす可能性があります。したがって、瞑想戦略のシフトパラダイム内の特定のタスク中に脳活動を反映するために、適切なタイミングで犠牲を実行することが重要です。ここで、ストレスは、コントロールと比較して男性のOFCにおける神経活性化の有意な増加を誘発した。 しかし、ストレスは、コントロールと比較して女性のOFCにおける神経活性化の有意な減少を誘発した。さらに、男性では、OFC活性化と基準への試験が負の相関であった。具体的には、より高いOFC活性化は、基準に対する試験の数が少ないことと関連していた。対照的に、女性におけるOFC活性化と性能との間に相関関係はなく、OFCがこれらの公演中に離脱したことを示唆した。
図1:トレーニング中やテスト日の間にパラダイムを変えるオペラ戦略の概略図。
図2:操作戦略シフトパラダイムからの代表的な行動データ。(A)試験日に各タスクの基準を判断する試行。サイド反転タスクでは、ストレスは男性のパフォーマンスを向上させたが、女性のパフォーマンスが低下した。軽い差別作業では、ストレスは女性のパフォーマンスを低下させましたが、男性には影響を与えませんでした。(B)テスト日の各タスクのエラー数。ストレスは男性の誤りの数を減らしたが、両方の側の逆転と軽い差別タスクで女性のエラーが増加した。(C)忍耐的および回帰的なエラー分類。ストレスは男性で行われた忍耐的な誤りを減少させたが、両方の側の逆転と軽い差別タスクで女性に行われた忍耐的な誤りを増加させた。(D)省略された試行の割合と、サイド反転タスクにおける基準までの時間。ストレスは雌ラットの省略率を増加した。ストレスは男性が必要とする時間を短縮したが、女性がタスクを完了するために必要な時間を増加した。統計は双方向のANOVAを使用して計算され、続いてTukeyのt検定(n = グループあたり12ラット、誤差範囲はSEM、0.10、*p<0.05#p ≤を表します)。この図は、以前の文書17から変更されています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
図3:オペラ戦略転換パラダイム後の代表的な神経活性化(A) 戦略シフトタスク後のOFCアクティベーション。明視野顕微鏡を用いて可視化したOFCにおけるc-fosに対する抗体を用いた免疫ヒストケミカル3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)染色の代表的な画像を、次に定量化した。ストレスは、男性のOFCにおける活性化(c-fos発現細胞の数によって示される)有意に増加し、一方で女性の活性化は減少した。右下の画像パネルのスケールバーは200 μmを表します。統計は双方向ANOVAを使用して計算され、続いてTukeyのt検定(n = 12ラット/グループ、ラット当たり6〜8個のOFCセクション、誤差範囲はSEM、*p<0.05)が続いた。 (B) OFC活性化と相関する側反転タスクにおける基準への試行。男性は有意な負の相関関係を示しましたが、女性はそうではないのに対 し、ここをクリックしてこの図のより大きなバージョンを表示してください。
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Discussion
プロトコルは、認知機能に対するストレスの影響を測定する方法を示しています。具体的には、修正されたオペラ戦略シフトパラダイムは、認知の柔軟性(人間のウィスコンシンカードソーティングタスクに似ています)を測定するげっ歯類で使用されます1.認知の柔軟性は、環境の新しい条件に直面する認知処理戦略を適応させる能力を示し、それは正常な毎日の機能2のために重要です。認知の柔軟性に関する人間の研究は、主に脳イメージング11に限定されるため、動物におけるこのパラダイムの使用は、脳と認知に対するストレスの影響の理解を大幅に進める。
ストレスは認知機能40を損なう可能性があります。実際、これは、PTSDやMDD3、41などのストレス関連疾患の中で最も一般的な表現型の1つです。さらに、ストレス関連精神疾患の発生には、5、6、7という大きな性差がありますが、これらの偏った発生の背後にある神経生物学の理解はほとんどありません。したがって、両方の男女の動物にパラダイムをシフトするこのオペラ戦略の使用は、精神医学における性差の現在の理解を進めるのに役立つ可能性があります。
このオペラ戦略シフトタスクは、研究者が精神疾患に関連する認知の重要な側面を調べることができます。例えば、実験的操作後の忍耐誤差は、このパラダイムで計算される。忍耐は、PTSDなどのストレス関連精神疾患において観察され、そして、それは、最終的にワーキングメモリを損なう、規則の新しいセットを学ぶために1の能力を損なう3。したがって、忍耐誤差の尺度は翻訳的に関連しています。さらに、注意タスクの省略は、PTSD患者において指摘されており、遅い皮質処理3を示す。したがって、このパラダイムからの省略データは、臨床的対応を有し得る。要するに、この実験的パラダイムモデルによって測定される認知の柔軟性は、精神疾患で観察される主要な表現型をモデル化する。
この実験的パラダイムはまた、認知の柔軟性の根底にある神経基質を標的にする精度を可能にする。例えば、前頭前野(PFC)は、内側前頭前頭前(mPFC)および眼窩前頭前野(OFC)を含む認知柔軟性3のための重要な脳領域であることを示している。PFCのこれらのサブ領域のうち、OFCはサイド反転タスク34、35でのパフォーマンスにとって重要である。これらの脳領域は、ストレス誘発機能変化の主要な標的でもある42,43.興味深いことに、ここで使用されるストレスのモデルは、認知の柔軟性のテストでげっ歯類のその後のパフォーマンスに役割を果たしているように見えます。したがって、将来の実験の設計において考慮されるべきである。ストレスに対するこれらの様々な応答は、認知がストレスの影響を受ける潜在的に新しいメカニズムを指しています。したがって、特定の神経伝達物質、タンパク質、またはこれらの脳領域の活性化を標的とすることは、ストレスが男性と女性のげっ歯類の認知にどのように影響するかについて光を当てる可能性があります。研究者は、ストレスや戦略シフトと組み合わせて異なるタイムポイントでこれらの神経基質を操作するか、またはこれらの行動パラダイムにさらされた後に神経基質を測定することを選択することができます。
この変更されたオペラ戦略のシフトタスクは、ストレス文献で使用される他の認知柔軟性パラダイム(すなわち、げっ歯類を訓練するために実験者によってより多くの時間と労力を必要とする掘削タスク12、13、14、15)よりも明確な利点を有する。この手順は、実験者による最小限の監視を必要とし、同時に複数のラットをテストすることができます。さらに、この自動化タスク19の他のバージョンとは異なり、パラダイムは3日間のトレーニングのみを必要とし、効率的なプログラムされたデータ分析を含みます。
オペラ戦略シフトパラダイムには一定の制限があります。1つの制限は、2つの刺激次元(例えば、左または右のレバーとライトキュー)しかテストできないのに対し、掘削タスク12、13、14、15は第3の刺激次元(例えば、メディアと臭い対テクスチャ)をテストすることができるということです。しかし、このプロトコルで説明されているタスクは、認知の柔軟性構造のテストを可能にする異なるルールに移行するラットの能力のテストをまだ可能にします。さらに、第三の刺激(例えば、臭い)を可能にするために、オペラ室に他のパラメータを追加することが可能であるが、これは、タスクに必要なトレーニングを延長する可能性がある。
このタスクの主な利点は、ストレスが脳に与える影響をさらに理解するために、ストレスや薬理学的操作と組み合わせるシンプルさと能力です。このシンプルさは、生態学的に関連する掘削作業と比較して、被験者がレバープレスを学んでいる間に直面する困難が増加することに留意すべきである。このオペラントタスクは労働集約的な作業がはるかに少ないが、げっ歯類は一般的にこのタスクを取得するためにより多くの試験を必要とします。しかし、掘削タスクとこのパラダイムの両方が同様の神経生物学的メカニズムを係合し、したがって、認知の柔軟性16、44の検査のための有効なオプションを表す。掘削タスクを使用して認知の柔軟性にストレスの影響に関する文献に様々な結果があったが、このオペラの手順23、25、27、45、46、提示された方法は、型、強度、およびストリッサーの持続時間が認知機能20、21に及ぼす複雑な影響を反映している。
タスクのもう 1 つの制限は、げっ歯類が閉じた不透明なボックスに収納されるということです。したがって、コンピュータインターフェイスを介して収集される動作以外の動作はコーディングできません。例えば、ラットによる多くの不作為は、ストレスによって引き起こされた行動阻害、またはラットが眠っているために起こっている。さらに、グルーミング(特にストレスの研究に関連する)などの他のステレオタイプな行動は、タスク中に分析するのが興味深いかもしれません。操作室にカメラを取り付けることは、このタイプの行動精度を可能にするかもしれません。
全体として、このレポートでは、ストレスが脳にどのような影響を与えるかをさらに理解するために、パラダイムをシフトするオペラ戦略と組み合わせてストレス手順の使用を詳述しています。注意すべき点は、成人におけるストレス手順と認知評価に加え、異なる発達段階に関する研究が、認知の柔軟性の病因に関する重要な情報を提供するかもしれないということに留意すべきである。ストレスが認知の柔軟性に及ぼす影響を研究することに加えて、このシンプルで効率的なオペラ戦略シフトパラダイムは、脳が環境の変化にどのように適応するかを調査するための多くの実験的操作と組み合わせることができます。さらに、代替の実験的アプローチは、病変、薬理学、遺伝子編集、電気生理学を含む認知柔軟性の神経基盤を研究するために使用することができます。認知の柔軟性が精神疾患の主要な表現型の1つであるため、神経生物学的基質をさらに理解するために、より多くの研究を行う必要があります。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もない。
Acknowledgments
著者たちは、ハンナ・ザモア、エミリー・サックス、ジョシュ・サールが、グラーフ研究所でパラダイムを変えるこのオペラ戦略を確立する手助けをしてくれたことに感謝したいと考えています。彼らはまた、分析のためのMATLABコードに彼の助けをしてくれたケビン・スナイダーに感謝したいと思います。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3 inch glass pipette eye droppers | Amazon | 4306-30-012LC | For vaginal lavage |
| Alcohol Wipes | VWR | 15648-990 | To clean trays in set shifting boxes between rats |
| Biotin-SP-conjugated AffiniPure Donkey Anti-Mouse lgG (H+L), minimal cross reaction to bovine, chicken, goat, guinea pig, hamster, horse, human, rabbit, sheep serum proteins | Jackson ImmunoResearch | 715-065-150 | All other DAB protocol staining materials are standard buffers/DAB and are not specified here, as this is not the main focus of the methods paper |
| C-fos mouse monoclonal primary antibody | AbCam | ab208942 | To stain neural activation in brain areas after set shifting |
| Dustless Food Pellets | Bio Serv | F0021 | For set shifting boxes (dispenser for reward) |
| GraphPad Prism | Used for data analysis | ||
| Leica DM4 B Microscope and associated imaging software | Leica | Lots of different parts for the microscope and work station, for imaging lavage and/or cfos | |
| MatLab | Software; code to help analyze set shifting data, available upon request. | ||
| Med-PC Software Suite | Med Associates | SOF-736 | Software; uses codes to operate operant chambers |
| Operant Chambers | Med PC | MED-008-B2 | Many different parts for the chamber set up and software to work with it; we also wrote a separate code for set shifting, available upon request. |
| Rat Bedding | Envigo | T.7097 | |
| Rat Chow | Envigo | T.2014.15 | |
| Restraint Devices | Bryn Mawr College | Made by our shop | For stress exposure; specifications available upon request. |
| Scribbles 3d fabric paint | Amazon | 54139 | For vaginal lavage |
| Sprague Dawley Rats | Envigo | At least D65 Males and Females | |
| VWR Superfrost Plus Micro Slide | VWR | 48311-703 | For vaginal lavage and/or brain slices/staining for c-fos |
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