Summary
Presentiamo qui un protocollo di un modello di onda d'urto per i roditori per studiare gli effetti neurobiologici e fisiopatologici di lesioni cerebrali traumatiche da lievi a moderate. Abbiamo stabilito una configurazione da banco a gas dotata di sensori di pressione che consentono una generazione affidabile e riproducibile di lesioni cerebrali traumatiche da lievi a moderate indotte da esplosioni.
Abstract
La lesione cerebrale traumatica (TBI) è un problema di salute pubblica su larga scala. Il TBI lieve è la forma più diffusa di neurotrauma e rappresenta un gran numero di visite mediche negli Stati Uniti. Attualmente non ci sono trattamenti approvati dalla FDA disponibili per TBI. L'aumento dell'incidenza di TBI militari e indotti da blasti accentua ulteriormente l'urgente necessità di trattamenti TBI efficaci. Pertanto, nuovi modelli animali preclinici di TBI che ricapitolano aspetti del TBI correlato all'esplosione umana faranno progredire notevolmente gli sforzi di ricerca sui processi neurobiologici e fisiopatologici alla base del TBI da lieve a moderato, nonché lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per TBI.
Qui presentiamo un modello affidabile e riproducibile per lo studio degli effetti molecolari, cellulari e comportamentali del TBI indotto da blast da lieve a moderato. Descriviamo un protocollo passo-passo per tbiti lievi a testa chiusa e indotti da esplosioni nei roditori utilizzando una configurazione da banco costituita da un tubo d'urto azionato da gas dotato di sensori di pressione piezoelettrici per garantire condizioni di prova coerenti. I vantaggi della configurazione che abbiamo stabilito sono il suo relativo basso costo, facilità di installazione, facilità d'uso e capacità di throughput elevato. Ulteriori vantaggi di questo modello TBI non invasivo includono la scalabilità della sovrapressione del picco di esplosione e la generazione di risultati riproducibili controllati. La riproducibilità e la rilevanza di questo modello TBI è stata valutata in una serie di applicazioni a valle, tra cui analisi neurobiologiche, neuropatologiche, neurofisiologiche e comportamentali, a supporto dell'uso di questo modello per la caratterizzazione dei processi alla base dell'eziologia del TBI da lieve a moderato.
Introduction
La lesione cerebrale traumatica (TBI) rappresenta oltre due milioni di visite ospedaliere ogni anno solo negli Stati Uniti. I TBI lievi comunemente derivanti da incidenti automobilistici, eventi sportivi o cadute rappresentano circa l'80% di tutti i casi di TBI1. Il TBI lieve è considerato la "malattia silenziosa" in quanto i pazienti spesso non manifestano sintomi evidenti nei giorni e nei mesi successivi all'insulto iniziale, ma possono sviluppare gravi complicanze correlate al TBI più tardi nella vita2. Inoltre, il TBI lieve indotto da blast è prevalente tra i membri del servizio militare ed è stato associato a disfunzione cronica del SNC3,4,5,6. A causa della crescente incidenza di TBI7,8 lieve correlato all'esplosione, la modellazione preclinica dei processi neurobiologici e fisiopatologici associati al TBI lieve è quindi diventata un punto focale nello sviluppo di nuovi interventi terapeutici per TBI.
Storicamente, la ricerca sul TBI si è concentrata principalmente sulle forme gravi di neurotrauma, nonostante il numero relativamente inferiore di casi gravi di TBI umano. Sono stati sviluppati modelli preclinici di roditori per TBI umani gravi, compresi i modelli di impatto corticale controllato (CCI)9,10 e lesioni da percussione fluida (FPI)11, entrambi ben consolidati per produrre effetti fisiopatologici affidabili12,13. Questi modelli hanno gettato le basi per ciò che è noto oggi sulla neuroinfiammazione, la neurodegenerazione e la riparazione neuronale nel TBI. Sebbene sia stata sviluppata una notevole conoscenza della fisiopatologia del TBI, attualmente non sono disponibili trattamenti efficaci approvati dalla FDA per tbi.
Più recentemente, il focus della ricerca TBI è stato ampliato per includere uno spettro più ampio di patologie correlate al TBI con l'obiettivo finale di sviluppare interventi terapeutici efficaci. Tuttavia, sono stati stabiliti pochi modelli preclinici per TBI lieve che hanno mostrato effetti misurabili e solo un piccolo numero di studi ha studiato lo spettro TBI lieve2,14,15. Poiché il TBI lieve rappresenta la grande maggioranza di tutti i casi di TBI, sono urgentemente necessari modelli affidabili di TBI lieve per facilitare la ricerca sull'eziologia e la neuropatofisiologia della condizione umana, al fine di sviluppare nuove strategie terapeutiche.
In collaborazione con ingegneri biomedici e fisici aerospaziali, abbiamo stabilito un modello scalabile di onde d'urto a testa chiusa per TBI da lieve a moderato. Questo modello di roditore preclinico è stato specificamente sviluppato per studiare gli effetti della dinamica della forza, comprese le onde d'urto e il movimento di accelerazione / decelerazione, che sono associati al LIEVE TBI umano ottenuto in combattimenti militari, eventi sportivi, incidenti automobilistici e cadute. Poiché le onde d'urto sono correlate con le dinamiche di forza che causano tbi lieve negli esseri umani, questo modello è stato progettato per produrre una forma d'onda di Friedlander coerente con un impulso, che viene misurato come libbre per pollice quadrato (psi) * millisecondo (ms). Il livello di impulso viene scalato per scendere al di sotto delle curve di letalità polmonare definite per topi e ratti al fine di condurre indagini precliniche16,17,18. Inoltre, questo modello consente di indagare sulle lesioni da colpo di stato e contrecoup dovute alle rapide forze di rotazione della testa dell'animale. Questo tipo di lesione è inerente a diversi tipi di presentazioni cliniche di TBI, comprese quelle osservate sia nella popolazione militare che in quella civile. Pertanto, questo modello versatile si adatta a un'esigenza che comprende più presentazioni cliniche di TBI.
Il modello preclinico qui presentato produce cambiamenti fisiopatologici affidabili e riproducibili associati a TBI clinica lieve, come dimostrato da una serie di studi precedenti17,19,20,21,22,23. Gli studi con questo modello hanno dimostrato che i ratti sottoposti a un'onda d'urto a bassa intensità hanno mostrato neuroinfiammazione, danno assonale, danno microvascolare, cambiamenti biochimici legati a lesioni neuronali e deficit di plasticità a breve termine ed eccitabilità sinaptica19. Tuttavia, questo modello lieve di TBI non ha indotto alcun cambiamento neuropatologico macroscopico, inclusi danni tissutali, emorragie, ematomi e contusioni19 che sono stati comunemente osservati in studi che hanno utilizzato modelli di TBI invasivi da moderati a gravi10,24. Ricerche precedenti19,21,22,23 hanno dimostrato che questo modello preclinico può essere utilizzato per caratterizzare i processi neurobiologici e fisiopatologici alla base dell'eziologia del TBI lieve e moderato17,19,20,21,22,23. Questo modello consente anche di testare nuovi composti e strategie terapeutiche, nonché l'identificazione di nuovi bersagli adatti per lo sviluppo di interventi TBI efficaci19,21,22,23.
Questo modello è stato sviluppato per studiare gli effetti indotti dalle onde d'urto e le forze rotazionali rapide sugli esiti molecolari, cellulari e comportamentali nei roditori. Analogamente al modello di onda d'urto qui presentato, è stato sviluppato un certo numero di modelli preclinici che tentano di ricapitolare TBI da lieve a moderato utilizzando onde di sovrapressione guidate dal gas2,14,17,25,26,27,28. Alcune delle limitazioni di altri modelli includono: l'animale è fissato a una gabbia di rete metallica e la testa è immobilizzata all'impatto; gli organi periferici sono esposti all'onda oltre al cervello, che crea le variabili confondenti del politrauma; e i modelli sono grandi e stazionari, il che limita la modifica e l'adattamento dei parametri critici a migliori condizioni del modello che ricordano il TBI umano.
I vantaggi di questa configurazione del tubo d'urto da banco a gas sono il suo costo relativamente basso per le spese di acquisizione e gestione, nonché la facilità di installazione e utilizzo. Inoltre, la configurazione consente un funzionamento ad alto rendimento e la generazione di onde d'urto riproducibili controllate e risultati in vivo sia nei topi che nei ratti. Al fine di controllare condizioni di prova coerenti (ad esempio, onda d'urto costante e sovrapressione) la configurazione è dotata di sensori di pressione. I vantaggi di questo modello per TBI includono la scalabilità della gravità della lesione e che il TBI lieve viene indotto utilizzando una procedura non invasiva a testa chiusa. La sovrapressione di picco e la successiva lesione cerebrale aumentano con membrane di poliestere più spesse in modo scalabile e coerente17. La capacità di scalare la gravità del TBI attraverso lo spessore della membrana è uno strumento utile per determinare il livello, al quale diventano evidenti specifiche misure di esito (ad esempio, neuroinfiammazione). Fornendo una schermatura protettiva per gli organi periferici, consente anche un'indagine mirata sui meccanismi del TBI lieve evitando o riducendo le variabili confondenti della lesione sistemica, come le lesioni polmonari o toraciche. Inoltre, questa configurazione consente di selezionare la direzione, con cui l'onda d'urto colpisce / penetra nella testa (cioè frontalmente, lateralmente, superiore o inferiore) e quindi possono essere indagati diversi tipi di insulti che inducono TBI. La procedura standard per indurre TBI da lieve a moderata qui descritta impiega l'esposizione laterale per valutare gli effetti della lesione da onda d'urto in combinazione con lesioni da colpo di stato e contrecoup a causa di forze di rotazione rapide. Inoltre, al fine di studiare esclusivamente le lesioni indotte da esplosioni, in questo modello può essere impiegata l'esposizione alle onde d'urto dall'alto verso il basso.
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Protocol
Il protocollo segue le linee guida per la cura degli animali dell'Università di Cincinnati e della West Virginia University. Tutte le procedure che coinvolgono gli animali sono state approvate dai Comitati Istituzionali per la Cura e l'Uso degli Animali (IACUC) e sono state eseguite secondo i principi della Guida per la Cura e l'Uso degli Animali da Laboratorio.
1. Installazione della configurazione BLAST TBI
- Acquisire tutte le parti di lavoro necessarie per la configurazione, tra cui: tubo d'urto costituito da sezione di azionamento e driver in acciaio, membrana in poliestere, bulloni di fissaggio, sensori di pressione, schermo per tubi in polivinilcloruro (PVC) per proteggere gli organi periferici, linea idraulica ad alta pressione da 9,53 mm e attacchi maschio e femmina a collegamento rapido, regolatore del gas ad alto flusso e una bombola del gas con staffa a parete (vedere Figura 1A, B e Tabella dei Materiali).
NOTA: Le specifiche della sezione guidata e driver utilizzata qui (vedere Figura 2 e Tabella dei materiali) sono state stabilite per produrre un'onda d'urto in scala di breve durata coerente (vedere Figura 3C, D) per indurre TBI da lieve a moderato nei topi. A tale scopo, è stata selezionata una sezione di driver corta progettata cono (cono di 6 °). La lunghezza e il diametro delle sezioni guidate e driver possono essere modificati per ricercare specificamente la dinamica dell'onda d'urto29,30,31,32, dell'onda di compressione18 o dell'onda d'urto33. Per gli esperimenti con i ratti, le dimensioni del tubo d'urto devono essere adattate per produrre forze comparabili in base ai parametri di ridimensionamento del corpo pertinenti17 (vedere Tabella dei materiali). - Installare le singole parti di lavoro del setup su tavoli di scorrimento della macchina fissati su una superficie stabile e facile da pulire (preferibilmente in acciaio inossidabile per l'uso nei roditori) in uno spazio di laboratorio approvato per esperimenti su animali.
NOTA: Gli esperimenti sulle onde d'urto producono un notevole livello di rumore; quindi scegli una posizione all'interno dello spazio di laboratorio fonoassorbente, dove il rumore non interferirà con altri esperimenti / gruppi di laboratorio.- Fissare lo scudo del tubo in PVC perpendicolare alla configurazione del tubo d'urto in modo che il corpo del roditore sia completamente coperto e solo la testa sporga.
NOTA: affinché la procedura standard per indurre TBI da lieve a moderata qui descritta, il centro della testa si trova a 5 cm dalla fine della sezione guidata per i topi. - Bombola del gas a parete in prossimità della configurazione in conformità con OSHA e tutte le altre normative di sicurezza pertinenti.
NOTA: aria compressa, elio o azoto gassoso sono comunemente usati per generare le onde d'urto dei roditori nei modelli di tubi d'urto dei roditori. Tutti i dati qui presentati sono stati generati utilizzando l'elio, poiché questo gas produce una sovrapressione più elevata per una durata più breve34, consentendo un ridimensionamento appropriato per i soggetti murini.
- Fissare lo scudo del tubo in PVC perpendicolare alla configurazione del tubo d'urto in modo che il corpo del roditore sia completamente coperto e solo la testa sporga.
2. Valutazione della configurazione e delle proprietà delle onde d'urto utilizzando le registrazioni del sensore di pressione.
- Preparare il tubo d'urto.
- Tagliare con cura la membrana in poliestere senza piegarsi e produrre fessure, al fine di garantire una rottura costante.
- Inserire la membrana tra le sezioni guidate e driver. Fissare le sezioni stringendo i bulloni di collegamento.
- Verificare che il sistema sia ermetico e che la membrana sia fissata saldamente tra il driver e le sezioni guidate.
- Collegare il serbatoio del gas tramite un tubo idraulico ad alta pressione da 9,53 mm e attacchi di collegamento rapido al tubo d'urto
NOTA: le sezioni driver e motorizzate sono lavorate con tolleranze precise al fine di garantire una tenuta completa della membrana tra le sezioni. Ciò non consente perdite di gas e preclude l'uso di qualsiasi forma di materiale guarnizione/o-ring e consente una maggiore coerenza nella forma d'onda generata.
- Installare i sensori di pressione per il monitoraggio delle onde d'urto (vedere Figura 1C).
- Posizionare un sensore di pressione nell'area di posizionamento della testa e tre sensori all'uscita del tubo d'urto (vedere figura 1C e 2).
- Avviare la registrazione dai sensori di pressione, appena prima dell'esecuzione delle onde d'urto. Registrare i dati dell'onda di pressione a 500.000 fotogrammi al secondo utilizzando un condizionatore di segnale del sensore e una scheda di acquisizione dati (vedere Tabella dei materiali).
NOTA: indossare paraorecchie approvati OHSA per garantire un'adeguata protezione dell'udito. - Aprire completamente la valvola principale del serbatoio del gas compresso per consentire al flusso di gas di produrre un improvviso e rapido picco di pressione.
NOTA: la sovrapressione del gas rompe la membrana di poliestere per rilasciare un'onda d'urto che si trasforma in un'onda di compressione all'interno della sezione guidata ed esce dal tubo nella direzione dell'area di posizionamento della testa. - Spegnere il flusso di gas immediatamente dopo la procedura.
NOTA: La configurazione può essere dotata di una valvola di ritorno a molla per arrestare automaticamente e rapidamente il flusso di gas. - Analizza le registrazioni delle onde di pressione utilizzando un programma per computer scritto personalizzato per determinare la sovrapressione di picco e i dati del grafico. I dati possono essere rappresentati graficamente con ciascun sensore singolarmente o sovrapposti l'uno sull'altro per dimostrare la planarità dell'onda generata (vedere Figura 3C,D).
NOTA: l'analisi può essere eseguita tecnicamente utilizzando software più facilmente disponibile, ma a causa dei grandi set di dati, questi programmi hanno lunghi ritardi nella generazione di grafici.
- Stabilire condizioni sperimentali adeguate allo scopo dello studio TBI designato e confermare che il modello produce un'onda d'urto coerente con una sovrapressione di picco, durata e misurazione dell'impulso paragonabile a un'onda di Friedlander (vedere figura 3). Verificare questi parametri utilizzando il software per computer di cui sopra.
- Calibrare l'impostazione ripetendo i passaggi 2.1.1. al 2.2.5. e utilizzare le registrazioni delle onde di pressione per determinare se la configurazione deve essere regolata (per i dati rappresentativi vedere la Figura 3).
- Modificare l'impostazione (se necessario).
NOTA: le proprietà dell'onda d'urto possono essere regolate con piccole modifiche della configurazione. Ad esempio, la distanza della testa fino alla fine della sezione guidata influisce sulla forza dell'onda d'urto a livello della testa. Lo spessore della membrana in poliestere determina il livello di sovrapressione di picco, con membrane più spesse che aumentano i livelli di picco (vedi Figura 3A,B). Inoltre, la configurazione consente di selezionare la direzione con cui l'onda d'urto colpisce / penetra nella testa (cioè testa-su, lato, sopra o sotto) e quindi diversi aspetti possono essere studiati, come la lesione da onda d'urto da sola o in combinazione con lesioni da colpo di stato e contrecoup a causa di forze rotazionali rapide. - Ripetere i passaggi da 2.1.1 a 2.2.4 per stabilire le proprietà desiderate dell'onda d'urto (se necessario) e controllare la riproducibilità.
- Ripetere i passaggi da 2.1.1 a 2.2.4 con membrane in poliestere di diverso spessore per valutare la scalabilità del setup (per i dati rappresentativi si veda la Figura 3A,B).
3. Preparazione dell'impostazione sperimentale e induzione di TBI lieve nei roditori
NOTA: Trasferire i roditori nell'area di detenzione da 30 minuti a 1 ora prima dell'inizio degli esperimenti TBI per acclimatarsi. Selezionare l'area di attesa minimamente influenzata dal rumore della procedura.
- Preparare tutti i materiali necessari per l'esperimento e controllare la configurazione per una corretta installazione (ad esempio, regolare i parametri in base allo scopo dello studio) (~ 5 - 10 minuti).
NOTA: la gravità della lesione può essere regolata selezionando lo spessore della membrana in poliestere. Sulla base dei nostri studi, uno spessore di membrana da 25,4 a 102 μm viene utilizzato per TBI da lieve a moderato nei topi35. In precedenza abbiamo utilizzato membrane con uno spessore da 76,2 a 127 μm per produrre TBI da lieve a moderato nei ratti19.- Tagliare con cura la membrana in poliestere, inserirla tra le sezioni guidate e driver e fissarla stringendo i bulloni di collegamento.
- Collegare il serbatoio del gas al tubo dell'ammortizzatore attraverso l'uso di raccordi a sgancio rapido. Assicurarsi che la membrana sia fissata saldamente tra il driver e le sezioni guidate.
- Posizionare tre sensori di pressione all'uscita del tubo d'urto, a 120° di distanza, per monitorare le proprietà dell'onda d'urto durante l'induzione del TBI come descritto ai punti 2.2.2 e 2.2.5.
- Assicurarsi che la distanza dall'estremità dell'apparato del tubo d'urto sia corretta per ogni rispettivo soggetto utilizzando il micrometro installato. Mantenere costante il posizionamento della testa del roditore (cioè posizione, distanza) all'interno degli studi per consentire una valutazione coerente delle lesioni.
NOTA: Come indicato al punto 1.2.1., è possibile indurre diversi tipi di lesioni selezionando la direzione in cui l'onda d'urto colpisce la testa. Affinché la procedura induca tbi da lieve a moderata qui descritta, il corpo viene posizionato perpendicolarmente al tubo d'urto che l'onda d'urto colpisce il lato della testa. In questo contesto, alla testa è consentita la libera mobilità e quindi è esposta all'onda d'urto e alle forze di rotazione rapida che consentono la generazione di effetti di colpo di stato e contrecoup. - Avviare la registrazione dai sensori di pressione utilizzando l'interfaccia utente grafica (GUI) del software.
- Anestesia e posizionamento dei roditori in configurazione
- Trasferire i roditori dalla sala di detenzione e indurre l'anestesia con il 4% di isoflurano in ossigeno e mantenere con il 2% di isoflurano in ossigeno per ridurre l'angoscia e il dolore.
NOTA: assicurarsi che l'animale non risponda al pizzico della punta o della coda prima di procedere. Assicurati che l'induzione dell'anestesia sia coerente per tutti gli animali da esperimento, compresi i controlli fittizi. Questa procedura richiede un basso livello e una breve durata dell'anestesia. - Posizionare il roditore completamente anestetizzato nello scudo del tubo in PVC con ammortizzazione per proteggere gli organi periferici dall'onda d'urto.
NOTA: i soggetti di controllo sono anestetizzati e posizionati in prossimità del setup, ma non sono direttamente sottoposti all'onda d'urto. Assicurarsi che i comandi siano sottoposti al rumore generato dal tubo d'urto. - Posizionare la testa del roditore all'interno dell'area di posizionamento della testa e sostenerla dal basso, tramite un supporto integrato direttamente nell'apparato di schermatura o una garza. Determinare l'allineamento della testa in base all'anatomia di ogni singolo roditore, con il condilo occipitale allineato con il bordo della schermatura protettiva.
NOTA: Evitare di dirigere l'onda di pressione direttamente verso il tronco cerebrale per ridurre la mortalità. La lesione al centro respiratorio del tronco cerebrale e del midollo spinale cervicale è nota per contribuire alle anomalie respiratorie e persino alla morte nei modelli di roditori di TBI36,37,38.
- Trasferire i roditori dalla sala di detenzione e indurre l'anestesia con il 4% di isoflurano in ossigeno e mantenere con il 2% di isoflurano in ossigeno per ridurre l'angoscia e il dolore.
- Esposizione dei roditori all'onda d'urto.
- Aprire rapidamente la valvola principale del serbatoio del gas compresso per produrre un picco di pressione che rompe la membrana e produrre una forte esplosione che conferma la generazione di un'onda di pressione. La membrana sarà visivamente rotta quando rimossa dopo l'esperimento.
NOTA: una telecamera ad alta velocità può essere utilizzata per catturare gli effetti di colpo e di contrecoup dell'accelerazione rotazionale sperimentata dal roditore per ulteriori analisi. - Spegnere il flusso di gas immediatamente dopo aver sentito l'esplosione.
- Aprire rapidamente la valvola principale del serbatoio del gas compresso per produrre un picco di pressione che rompe la membrana e produrre una forte esplosione che conferma la generazione di un'onda di pressione. La membrana sarà visivamente rotta quando rimossa dopo l'esperimento.
- Recupero dall'esposizione alle onde d'urto
- Dopo l'esposizione alle onde d'urto, rimuovere il roditore dall'apparecchio e posizionarlo su una superficie piana direttamente adiacente al tubo d'urto su un lato.
- Monitorare i soggetti per determinare il tempo riflesso di raddrizzamento (RRT). Usa un cronometro per registrare il tempo dall'esposizione alle onde d'urto fino a quando non riacquistano il riflesso di raddrizzamento intrinseco. (vedi Figura 4A).
- Non appena i soggetti riacquistano il loro riflesso raddrizzante, metterli nella rispettiva gabbia domestica dove vengono monitorati per le reazioni avverse (ad esempio, convulsioni, difficoltà respiratorie, sanguinamento da un orifizio corporeo) per le successive 24 ore.
- Dopo il periodo di monitoraggio iniziale, i soggetti possono essere analizzati utilizzando vari saggi biochimici, neuropatologici, neurofisiologici e comportamentali a scelta del ricercatore (vedi sotto).
- Preparare la configurazione e lo spazio per il prossimo esperimento.
- Configurazione pulita con detergente per rimuovere l'odore.
4. Applicazioni a valle per roditori esposti a onde d'urto/forze di rotazione e controlli
NOTA: In studi precedenti, gli effetti del TBI da lieve a moderato in vari punti temporali dopo l'esposizione a un'onda d'urto e alle forze rotazionali sono stati valutati nei roditori utilizzando applicazioni a valle, tra cui analisi biochimiche, neuropatologiche, neurofisiologiche e comportamentali19.
- Analisi biochimiche
- In punti temporali sperimentali definiti (da ore a giorni dopo il TBI lieve), prelevare tessuto (ad esempio, cervello, sangue) per l'analisi biochimica utilizzando protocolli standard come descritto19.
- Utilizzare il tessuto per l'analisi biochimica (ad esempio, immunoblotting, ELISA, ecc.) per valutare l'effetto del TBI lieve sui processi neurobiologici e fisiopatologici.
- Analisi neuropatologica
- In punti temporali sperimentali definiti (da ore a giorni dopo il TBI lieve), perfondere i roditori transcardialmente con una soluzione salina seguita da una soluzione di paraformaldeide al 4% per fissare il tessuto come descritto19.
NOTA: Alcune applicazioni non sono compatibili con la fissazione della paraformaldeide (ad esempio, colorazione dell'argento, alcuni anticorpi per l'immunoistochimica). - Utilizzare tessuto fisso perfuso per analisi anatomiche, istologiche e molecolari per valutare i cambiamenti neuropatologici associati a TBI lieve, tra cui neuroinfiammazione, neurodegenerazione e cambiamenti neurochimici come descritto19.
- In punti temporali sperimentali definiti (da ore a giorni dopo il TBI lieve), perfondere i roditori transcardialmente con una soluzione salina seguita da una soluzione di paraformaldeide al 4% per fissare il tessuto come descritto19.
- Analisi neurofisiologica in fette di cervello
- In punti temporali sperimentali definiti (da ore a giorni dopo il TBI lieve), sacrificare i roditori per decapitazione, rimuovere il cervello e preparare fette di cervello come descritto19.
- Eseguire registrazioni elettrofisiologiche come descritto19 per valutare l'effetto del TBI lieve sulle proprietà sinaptiche basali e sulla plasticità sinaptica.
- Analisi comportamentale
- In punti temporali sperimentali definiti (da ore a giorni dopo il TBI lieve), valutare le prestazioni comportamentali, compresa la funzione motoria (ad esempio, campo aperto, rotarod, attività locomotoria; vedere figura 4D) e l'apprendimento e la memoria (ad esempio, condizionamento della paura, labirinto di Barnes, labirinto d'acqua di Morris).
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Representative Results
La scalabilità della configurazione delle onde d'urto è stata testata utilizzando tre diversi spessori di membrana, 25,4, 50,8 e 76,2 μm. I livelli di pressione di picco sono stati valutati nell'area di posizionamento della testa e l'uscita dell'apparato del tubo d'urto utilizzando sensori di pressione piezoelettrici (vedere Figura 1 e Figura 2). Le pressioni di picco aumentano in concordanza con lo spessore della membrana in entrambe le posizioni del sensore (Figura 3A, B), dimostrando che la pressione di picco è di natura scalabile. Questa proprietà del setup può essere sfruttata per calibrare il sistema e valutarne la scalabilità come descritto nel passaggio 2.3.
Al fine di valutare gli effetti del TBI indotto da blast in vivo, topi C57Bl/6J adulti, maschi di 3 mesi, maschi, wild-type sono stati esposti alle onde d'urto prodotte da questa configurazione (Figura 1 e Figura 2) utilizzando il protocollo descritto qui. In primo luogo, sono stati valutati gli effetti delle onde d'urto prodotte con due diversi spessori di membrana (50,8 e 76,2 μm) o del trattamento fittizio sul tempo riflesso di raddrizzamento (RRT) (Figura 4A). La latenza dei topi per raddrizzarsi completamente (4 zampe a terra) dopo l'anestesia è determinata qui come RRT. I topi sono stati anestetizzati usando isoflurano (anestesia coerente, breve e lieve) e poi sottoposti a induzione tbi o trattamento fittizio. Immediatamente dopo l'infortunio, ai topi è stato permesso di recuperare ed è stato registrato il tempo per recuperare il riflesso di raddrizzamento. I topi che sono stati esposti a un'onda d'urto prodotta con la membrana da 76,2 μm hanno mostrato un aumento significativo della RRT rispetto ai controlli fittizi sottoposti alla stessa procedura di anestesia (Figura 4A), suggerendo che questa onda d'urto induce perdita di coscienza. Al contrario, i topi esposti a un'onda d'urto dalla membrana da 50,8 μm non mostrano aumenti significativi di RRT (Figura 4A), indicativi di una forma lieve di TBI. La rottura di una membrana standard di poliestere da 76,2 μm provoca la rapida generazione di un'onda d'urto di breve durata di circa 160 psi di sovrapressione (Figura 3C), a cui è esposto il lato sinistro del cranio del soggetto durante la procedura sperimentale.
Gli effetti fisiologici a breve termine che si verificano dopo l'esposizione alle onde d'urto e alle forze rotazionali nei roditori non sono attualmente ben caratterizzati. Per delineare gli effetti acuti dell'esposizione alle onde d'urto e delle forze rotazionali da questo modello, abbiamo valutato la regolazione della temperatura corporea interna e il peso corporeo. La temperatura e il peso corporeo dei topi C57Bl/6J maschi di tipo selvatico adulti, di 3 mesi, sono stati registrati dopo l'induzione del TBI. La temperatura corporea interna al basale e il peso corporeo sono stati registrati nei topi prima della procedura TBI o del trattamento fittizio. L'esposizione a un'onda d'urto prodotta con la membrana da 76,2 μm ha ridotto significativamente la temperatura corporea durante la prima ora nei topi indotti da TBI rispetto ai loro controlli fittizi (Figura 4B), indicativo di un significativo effetto fisiologico prodotto dall'induzione del TBI. Coerentemente, i topi sottoposti a TBI utilizzando membrane da 76,2 μm hanno mostrato una riduzione acuta, dipendente dal tempo ma significativa del peso corporeo totale di un giorno post-TBI rispetto a sham (Figura 4C).
Al fine di esaminare l'impatto del TBI sugli esiti comportamentali, è stato analizzato l'effetto del TBI indotto da blast sull'attività locomotoria acuta (Figura 4D). Topi adulti, maschi di 3 mesi, C57Bl/6J sono stati sottoposti a induzione di TBI utilizzando un trattamento a membrana o sham da 76,2 μm e l'attività locomotoria è stata monitorata per 30 minuti tre ore dopo il TBI. L'esposizione a un'onda d'urto prodotta con la membrana da 76,2 μm ha determinato una diminuzione acuta e significativa dell'attività locomotoria (Figura 4D).
Figura 1: Configurazione del modello murino di onde d'urto. (A-C) Immagini rappresentative della configurazione del modello di onda d'urto per topi. Vista laterale del setup (A). Vista dall'alto della configurazione (B). 1, bombola di gas con regolatore di gas ad alto flusso; Linea idraulica ad alta pressione da 2, 9,53 mm e attacchi maschio e femmina a collegamento rapido; 3, sezione driver del tubo d'urto; 4, sezione guidata del tubo d'urto; 5, schermo per tubi in PVC; 6, area di posizionamento della testa; 7, membrana in poliestere. Le singole parti del setup sono installate su tavoli di scorrimento della macchina che consentono un posizionamento preciso del driver (3) e delle sezioni guidate (4) in relazione al soggetto sottoposto a induzione di lesioni. (C) Vista dall'alto della configurazione con posizionamenti del sensore di pressione. Tre sensori si trovano su un piano all'uscita del tubo d'urto, a 120 gradi di distanza (S1 - S3), per monitorare le proprietà dell'onda d'urto durante l'induzione del TBI. Un sensore è installato nell'area di posizionamento della testa (S4). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Schema del tubo d'urto di sovrapressione murina. Il tubo d'urto lavorato con precisione è realizzato in acciaio ad alta resistenza. Lo spazio interno della sezione del driver è inclinato di 6 gradi. Il diametro interno del driver e della sezione guidata è di 37 mm. Le superfici di accoppiamento delle sezioni guidate dal conducente sono lavorate con precisione per garantire una tenuta completa. L'intero tubo d'urto è fissato industrialmente a una tavola di scorrimento della macchina per garantire un montaggio solido e la coerenza della generazione di onde d'urto. All'uscita della sezione guidata vengono praticati dei fori (su un piano, a 120° di distanza) per installare i tre sensori di pressione (indicati da *). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Registrazioni di pressione dalla configurazione delle onde d'urto murine. (A,B) La pressione di picco è scalabile e dipende dallo spessore della membrana in poliestere. I sensori di pressione sono stati utilizzati per registrare le pressioni di picco prodotte dal tubo d'urto con membrane di gas elio e poliestere di spessore 25,4, 50,8 o 76,2 μm. (A) Nell'area di posizionamento della testa, la pressione media di picco prodotta con membrane da 25,4 μm è stata di 428 ± 15,9 kPa, con membrane da 50,8 μm 637 ± 21,4 kPa e con membrane da 76,2 μm 1257 ± 40,7 kPa (SEM, n = 7-12, ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto post-hoc di Dunnett, *** P ≤ 0,001). (B) All'uscita del tubo d'urto, la pressione media di picco registrata con membrane da 25,4 μm era di 164 ± 11,7 kPa, con membrane da 50,8 μm 232 ± 11,7 kPa e con membrane da 76,2 μm 412 ± 11,0 kPa (SEM, n = 7-12, ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto post-hoc di Dunnett, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001). (C) Grafico rappresentativo della registrazione della pressione dal sensore nell'area di posizionamento della testa (sensore incidente) utilizzando una membrana da 76,2 μm. La forma d'onda è simile a quella di un'onda di Friedlander, scalata in tempo/durata per soggetti murini. (D) Grafico rappresentativo della registrazione della pressione da 3 sensori distinti situati all'estremità della sezione guidata per determinare la linearità/fase della forma d'onda all'interno della sezione guidata. Tutti e tre i sensori (situati a 120 gradi di distanza) mostrano una durata di salita/discesa simile, indicando che la forma d'onda che lascia la sezione guidata è simile nella sezione trasversale all'interno della sezione guidata. L'onda d'urto è stata generata utilizzando una membrana da 76,2 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Effetti acuti in vivo del TBI indotto da blast. (A) Tbi moderato, ma TBI non lieve aumenta il tempo riflesso di raddrizzamento (RRT). Topi adulti, maschi di 3 mesi, maschi, wild-type C57Bl / 6J sono stati sottoposti a procedure TBI utilizzando il tubo d'urto con gas elio e membrane di poliestere di spessore 50,8 o 76,2 μm o trattamento fittizio. Immediatamente dopo un infortunio o un trattamento fittizio, ai topi è stato permesso di riprendersi e la RRT è stata registrata. L'induzione del TBI con membrana da 50,8 μm o il trattamento fittizio hanno mostrato livelli comparabili di RRT. Al contrario, l'induzione tbi utilizzando una membrana da 76,2 μm aumenta l'RRT, indicativo di una perdita di coscienza indotta dall'onda d'urto con la membrana da 76,2 μm (SEM, n = 4-10, Sham RRT = 35,6 ± 2,0 s, membrana 50,8 μm RRT = 43,0 ± 4,3 s e membrana 76,2 μm RRT = 254,0 ± 40,2 s, ANOVA unidirezionale seguito dal test di confronto post-hoc di Dunnett, P ≤ 0,001). (B) Il TBI moderato riduce significativamente e transitoriamente la temperatura corporea interna. Topi adulti, maschi di 3 mesi, maschi, wild-type C57Bl/6J sono stati sottoposti a induzione di TBI con membrane da 76,2 μm o trattamento fittizio. La loro temperatura corporea interna è stata registrata per due ore. La temperatura corporea interna al basale è stata registrata prima dell'induzione del TBI. Il TBI indotto da blast con membrane da 76,2 μm è associato a un calo significativo della temperatura corporea interna entro la prima ora post-TBI. (SEM, n = 10, misure ripetute bidirezionali ANOVA, seguite dai test di confronto multipli post-hoc di Bonferroni, ** P ≤ 0,01, *** P ≤ 0,001). (C) Un TBI moderato provoca una riduzione transitoria del peso corporeo. Topi adulti, maschi di 3 mesi, C57Bl / 6J sono stati sottoposti a procedure TBI utilizzando membrane da 76,2 μm o trattamento fittizio. Successivamente, i pesi corporei sono stati registrati per 5 giorni. Il peso corporeo totale è stato significativamente ridotto di un giorno dopo il TBI (SEM, n = 7, misure ripetute bidirezionali ANOVA seguite dai test di confronto multipli post-hoc di Bonferroni, * P ≤ 0,05). (D) Tbi moderato provoca una riduzione acuta dell'attività locomotoria. Topi adulti, maschi di 3 mesi, C57Bl / 6J sono stati sottoposti a procedure TBI utilizzando membrane da 76,2 μm o trattamento fittizio. Tre ore di attività locomotoria post-TBI sono state monitorate per 30 minuti e quantificate utilizzando un software di tracciamento video (SEM, n = 9-11, t-test a due code spaiato, ** P = 0,01). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Presentiamo qui un modello preclinico di TBI lieve che è conveniente, facile da configurare ed eseguire e consente risultati sperimentali ad alta produttività, affidabili e riproducibili. Questo modello fornisce una schermatura protettiva agli organi periferici per consentire un'indagine mirata sui meccanismi tbisidi lievi, limitando al contempo le variabili confondenti del danno sistemico. Al contrario, altri modelli di esplosione sono noti per infliggere danni agli organi periferici2,39,40. Un altro vantaggio di questo modello è la sua capacità di erogare l'onda d'urto da qualsiasi angolazione desiderata rispetto alla posizione fissa in altri modelli di granigliatura40. Ciò consente studi anatomici mirati per comprendere meglio la vulnerabilità del cervello.
Al fine di studiare il TBI correlato all'esplosione umana, un modello pertinente per il TBI dovrebbe produrre forze biomeccaniche paragonabili a quelle sperimentate dai soggetti durante l'induzione del TBI. Un modello clinicamente rilevante dovrebbe anche indurre esiti neurobiologici, fisiopatologici e comportamentali osservati in soggetti affetti da LIEVE TBI. In studi precedenti, il modello di onde d'urto qui presentato è stato accuratamente esaminato17,19,21 e sono stati valutati numerosi aspetti biofisici e neurobiologici che ricordano il TBI umano, tra cui la dinamica e le forze delle onde d'urto, la neuroinfiammazione, la lesione assonale e il danno microvascolare. Questi studi hanno fornito la prova che questo modello preclinico di onde d'urto per TBI produce cambiamenti neurobiologici e fisiopatologici affidabili e riproducibili associati a TBI clinici.
Inoltre, con l'aumento dell'incidenza di TBI blast lieve all'interno della popolazione militare7,8, questo versatile modello di roditore per TBI umano lieve fornisce ai ricercatori uno strumento prezioso per studiare i processi alla base del TBI correlato all'esplosione ed esplorare nuove strategie terapeutiche. Ad esempio, il nostro modello dimostra complicazioni neurovascolari e sottolinea l'importanza dell'intervento vascolare come approccio terapeutico promettente22,23,35. Coerentemente, altri modelli preclinici di TBI blastico hanno anche prodotto effetti neurovascolari associati a neurodegenerazione e deficit comportamentali2,25,40,41,42,43.
Sulla base di ricerche precedenti19,21,22,23, abbiamo stabilito che il modello di onda d'urto qui presentato potrebbe essere adatto per l'indagine sulla fisiopatologia e l'eziologia della commozione cerebrale umana. La maggior parte dei modelli preclinici di TBI non consente il movimento della testa44 anche se le proprietà biomeccaniche associate alla rapida accelerazione/decelerazione della testa sono un fattore predittivo per lo sviluppo di una commozione cerebrale nell'uomo45,46. Coerentemente con il modello qui descritto, Goldstein e colleghi14 hanno dimostrato che il rapido movimento della testa indotto dalle forze di esplosione è un prerequisito per l'induzione di deficit comportamentali, probabilmente dovuti a forze rotazionali e taglio. Una migliore comprensione dei cambiamenti fisiopatologici che si verificano nel TBI lieve e in risposta alla commozione cerebrale aiuterebbe anche a determinare i biomarcatori clinici e identificare nuovi bersagli per lo sviluppo di trattamenti per TBI.
Poco si sa sui cambiamenti fisiopatologici e sulla progressione della malattia a seguito di TBI lieve ripetitivo (ad esempio, commozione cerebrale ripetitiva sperimentata nello sport). Questo modello preclinico consente lo studio di TBI lievi ripetitivi con mortalità minima o nulla. Al contrario, alcuni modelli di TBI infliggono gravi lesioni, e quindi è spesso difficile, o disumano, indurre ulteriori lesioni. Inoltre, le lesioni gravi sono spesso irreparabili e l'individuazione di sottili cambiamenti fisiologici può essere preclusa. Questo modello consente anche l'indagine scalabile di vari intervalli di interlesioni; un parametro critico per il TBI lieve ripetitivo che richiede un'ulteriore caratterizzazione. Dopo il TBI, viene attivata una risposta alle lesioni del SNC che aiuta a proteggere l'integrità del cervello e prevenire la morte diffusa delle cellule neuronali. La risposta alla lesione può essere, infatti, influenzata in modo significativo dall'induzione di un'altra lesione entro un breve periodo di tempo dopo la lesione iniziale. Questo modello consente di studiare l'intervallo tra le lesioni, che è un aspetto importante della progettazione di studi clinici per TBI lievi ripetitivi. Inoltre, questo modello scalabile consente un rapido flusso di lavoro ad alto rendimento, che facilita l'indagine di più parametri contemporaneamente, nonché la valutazione dell'attività terapeutica di nuovi interventi.
Una limitazione di questo modello è l'incapacità di controllare le proprietà dell'onda d'urto tra l'uscita del tubo e la testa dell'animale. Sebbene l'onda d'urto sia turbolenta all'uscita dal tubo d'urto, le misure di esito sono ancora affidabili e riproducibili con un posizionamento coerente della testa del roditore18. Pertanto, è importante mantenere costanti le impostazioni sperimentali (cioè la posizione della testa e la distanza dall'uscita del tubo d'urto) tra tutti gli studi. Al fine di ottimizzare la progettazione e il protocollo del modello, la dinamica della forma d'onda tra l'uscita del tubo e l'area di posizionamento della testa è stata misurata (Figura 3) e modellata utilizzando simulazioni numeriche18. I progetti futuri integreranno la modellazione agli elementi finiti per determinare come la dinamica della forza si trasferisce dal cranio alle meningi, al liquido cerebrospinale e infine nel tessuto cerebrale. La complessa interazione tra dinamica della forza e biofisica e le conseguenti risposte fisiologiche sono aree importanti nella ricerca sul TBI che sono state finora sottoesplorate.
In sintesi, presentiamo qui un protocollo e un esperimento visualizzato di un modello di lesione da onda d'urto che è stato sviluppato per studiare gli effetti del TBI lieve. L'esperienza collettiva di ingegneri, medici e scienziati biomedici ha contribuito all'ottimizzazione della sua validità biofisica/fisiologica e rilevanza neurobiologica. Questo modello è stato accuratamente convalidato e ha già prodotto risultati significativi, in particolare nella comprensione delle prime dinamiche di TBI lieve17,19,20,21,22,23. Lo sfruttamento di questo modello preclinico per studiare ulteriormente il TBI lieve farà progredire significativamente la nostra comprensione della fisiopatologia e dell'eziologia del TBI e contribuirà allo sviluppo di nuovi interventi a beneficio dei pazienti affetti da TBI.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.
Acknowledgments
Ringraziamo R. Gettens, N. St. Johns, P. Bennet e J. Robson per il loro contributo allo sviluppo del modello TBI. NARSAD Young Investigator Grants della Brain & Behavior Research Foundation (F.P. e M.J.R.), una borsa di ricerca del Darrell K. Royal Research Fund for Alzheimer's Disease (F.P.) e un PhRMA Foundation Award (M.J.R.) hanno sostenuto questa ricerca. Questo lavoro è stato sostenuto attraverso borse di studio pre-dottorato dalla American Foundation for Pharmaceutical Education (A.F.L e B.P.L.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3/8 SAE High Pressure Hydraulic Hose | Eaton Aeroquip | R2-6-6-36M | Available from Grainger |
| 3/8'' Quick Connect Female Plugs | Karcher | KAR 86410440 | |
| 3/8'' Quick Connect Male Plugs | Karcher | KAR 86410440 | |
| ANY-maze video tracking software | Stoelting Co. | ANY-maze software | |
| Clear Mylar membrane | ePlastics.com | POLYCLR0.003 | http://www.eplastics.com/Plastic/Clear_Polyester_Film/POLYCLR0-003; Clear Mylar membrane is sold in various thicknesses. All are sold by vendor listed above. |
| Compound Slide Table (X2) | Grizzly Industrial | G5757 | |
| Deadman Gas Control Ball Valve | Coneraco Inc. | 71-502-01 | "Apollo", Available from Grainger |
| Driver and driven section (murine) | own design/production | n/a | For further information please contact the authors |
| Driver and driven section (rat) | own design/production | n/a | For further information please contact the authors |
| Ear Muffs | 3M | 37274 | Available from Grainger |
| Gas Regulator - Hi Flow 3500-600-580 | Harris | 3003539 | |
| Helium Gas | AirGas | HE 300 | Tanks are available in various sizes |
| Inhalation Anesthesia System | VetEquip | 901806 | |
| Input Module | National Instruments | NI 9223 | |
| Isoflurane | Baxter | NDC 10019-360-40 | Ordered by veterinarian |
| Laboratory Timer/Stopwatch | Fisher Scientific | 50-550-352 | |
| Labview version 12.0 | National Instruments | Data Acquistion Software | |
| Magnetic Dial Indicator/Micrometer | Grizzly Industrial | G9849 | |
| MATLAB | MathWorks | Software for pressure recording analysis | |
| Oxygen Regulator | Medline | HCS8725M | |
| PC for Data Processing | Dell | ||
| Polyvinylchloride Tubing - 25.4 mm | FORMUFIT | P001FGP-WH-40x3 | |
| Pressure sensors | PCB Piezotronics | 102A05 | |
| Receiver USB Chassis | National Instruments | DAQ-9171 | |
| Sensor Signal Conditioner | PCB Piezotronics | 482C series | |
| Stainless NSF-Rated Mounting Table | Gridmann | GR06-WT2448 | |
| T Handle Allen Wrench - 3/16'' | S&K | 73310 |
References
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