Summary
A poliploidização induzida por feridas é uma estratégia de reparação de tecidos conservada onde as células crescem em tamanho em vez de se dividirem para compensar a perda celular. Aqui está um protocolo detalhado sobre como usar a mosca frutífera como modelo para medir a ploidia e sua regulação genética no reparo de feridas epiteliais.
Abstract
A poliploide é um fenômeno frequente cujo impacto na saúde e na doença do organismo ainda é pouco compreendido. Uma célula é definida como poliploide se contém mais do que a cópia diploide de seus cromossomos, que é resultado de endoreplicação ou fusão celular. Na reparação de tecidos, a poliploidização induzida por feridas (WIP) tem sido considerada uma estratégia de cura conservada de moscas frutíferas a vertebrados. A WIP tem várias vantagens sobre a proliferação celular, incluindo resistência ao crescimento oncogênico e estresse genotoxico. O desafio tem sido identificar por que as células poliploides surgem e como essas células únicas funcionam. Fornecido é um protocolo detalhado para estudar WIP no epitélio de mosca de fruta adulta onde as células poliploides são geradas dentro de 2 dias após uma perfuração. Aproveitando o extenso kit de ferramentas genéticas de D. melanogaster, os genes necessários para iniciar e regular a WIP, incluindo Myc, começaram a ser identificados. Estudos contínuos usando este método podem revelar como outras variáveis genéticas e fisiológicas, incluindo sexo, dieta e idade, regulam e influenciam a função da WIP.
Introduction
Drosophila melanogaster é um sistema modelo atraente para estudar os mecanismos celulares e moleculares de reparação de feridas epiteliais. Como nos mamíferos, os mecanismos de reparação tecidual utilizados dependem tanto do tecido quanto do seu estágio de desenvolvimento. A cicatrização da ferida ocorre no embrião da mosca-das-frutas onde uma "corda de bolsa" de actomyosina se forma na borda de liderança epitelial permitindo que a ferida feche perfeitamente1,,2. A cicatrização de feridas pós-embrionárias em larvas, pupas e moscas de frutas adultas resulta em remodelação de matriz extracelular, formação de cicatrizes de melanina e crescimento de células epiteliais3,4,,5,6. As células epiteliais aumentam de tamanho por fusão celular e o endociclo, um ciclo celular incompleto que contorna a mitose3,,4,,7,,8. Como resultado, a perda celular é compensada pelo crescimento de células poliploides em vez da divisão celular. O hindgut de mosca adulto, midgut e epitélio folicular também dependem do crescimento de células poliploides para compensar a perda celular após danos teciduais9,,10,11.
A poliploide é um aspecto bem conhecido do desenvolvimento do organismo em plantas e insetos, mas nos últimos anos tornou-se mais evidente que a poliploide é uma estratégia de reparação de tecidos conservada em vertebrados12. O zebrafish, que tem a capacidade de regenerar seu coração, conta com o crescimento de células poliploides para curar o epicardiumdanificado 13. A poliploide também contribui para a regeneração hepática dos mamíferos e reparação do epitélio do túbulo renal após lesão aguda14,15. Nestes exemplos, as células poliploides são geradas por endoreplicação através de endociclo ou endomitose, o que resulta em uma célula binucleada devido a um bloco em citocinas12. O enigma é o motivo pelo qual as células poliploides surgem durante o reparo da ferida e como a poliploida afeta a função tecidual. Estudos recentes forneceram uma nova visão sobre a questão de se a poliploide oferece uma vantagem curativa ou desvantagem. No epicárdio de zebrafish, a poliploidia aumentou a velocidade da cicatrização da ferida13. Em D. melanogaster hindgut e fígado mamífero, a poliploide foi encontrada como protetora contra o crescimento oncogênico11,14. No epitélio de mosca adulto, foi recentemente descoberto que a poliploide permite o reparo da ferida na presença de estresse genotoxico16. A endoreplicação é resistente aos danos do DNA, permitindo a cicatrização de feridas quando a proliferação celular seria comprometida17. Para cardiomiócitos em corações de camundongos e zebrafish, no entanto, a poliploide retarda a cicatriz, resultando em maior formação de cicatrizes18,19. Portanto, dependendo do tipo de órgão e/ou celular, a poliploide pode ser uma estratégia benéfica ou prejudicial de reparação tecidual. A acessibilidade da genética de D. melanogaster juntamente com a análise da resposta de poliploidização induzida por feridas (WIP) fazem dele um sistema modelo ideal para elucidar os mecanismos moleculares e celulares que guiam essa estratégia de cicatrização da ferida.
Aqui, apresentamos um protocolo para analisar wip no epitélio D. melanogaster adulto. Incluem-se instruções para lesão de mosca-das-frutas, dissecção, imunostaining, montagem, imagem e análise de re-epitelialização, fusão celular e endoreplicação (ploidy). A análise de imagem e ploidia também pode ser adaptada a outros modelos para testar se ocorre WIP. Deve-se notar que, com um aumento no conteúdo do DNA nuclear, muitas vezes há um aumento correspondente no tamanho nuclear. No entanto, há muitos exemplos na biologia onde o tamanho nuclear não reflete uma mudança correspondente na ploidy20. Ainda mais cautela deve ser tomada ao interpretar o tamanho nuclear no contexto de um ambiente de ferida onde as células muitas vezes se espalham ou se alongam para cobrir o local da ferida. Portanto, a única prova definitiva de mudança na ploidia é medir o conteúdo de DNA por este método (ou outros, como sequenciamento de genoma inteiro)21. Este método aumenta a adequação do epitélio abdominal D. melanogaster adulto como modelo para estudar o papel e regulação da poliploida no reparo da ferida.
Protocol
1. Encenação e ferimento de moscas de frutas adultas
- Selecione D. melanogaster strain of choice (ou seja, epi-Gal4/ UAS strain, see Table of Materials).
NOTA: Aqui, o sistema Gal4/UAS é usado para permitir a expressão genética específica epitelial (epi-Gal4) de um gene ou RNAi codificado a jusante de UAS. Este estudo utiliza proteína de membrana fluorescente (UAS-Cd8.mRFP), indutor mitótico (UAS-fzrRNAi, UAS-stg) e inibidor de WIP (UAS-E2F1RNAi; UAS-RacDN). - Colete dois frascos de 10-15 moscas de frutas fêmeas recém-fechadas cada uma e a idade em frascos de alimentos frescos a 25 °C até 3-5 dias de idade. Um frasco servirá como controle ileso e o outro frasco será ferido conforme descrito abaixo. As moscas fêmeas devem ser mantidas com machos (~5/frasco).
- Para ferir as moscas, monte vários suportes de pinos cada um com um único pino de aço inoxidável de 0,10 mm. Certifique-se de que a extremidade afiada do pino está virada para fora. Os pinos podem facilmente dobrar ou chip depois de perfurar a mosca e pinos fisgados ou danificados devem ser descartados.
- Anestesiar as moscas de frutas fêmeas envelhecidas em uma almofada de mosca de CO2sob um estereóquio e alinhá-las em uma fileira usando um pincel de tinta. Usando óculos de segurança, segurando o suporte do pino em uma mão e fórceps na outra, use fórceps para posicionar uma mosca com seu abdômen ventral voltado para cima.
- Puna as moscas fêmeas adultas dentro da região pleurite epitelial do tergite A4 em ambos os lados das estelas da linha média ventral(Figura 1A). A puncturação desta região ventral proporciona um espaço ideal longe dos locais de dissecção onde as bordas teciduais serão rasgadas pelo processamento mecânico.
- Retorne moscas feridas ao frasco de comida e idade ao dia desejado após lesão (dpi). A cicatrização da ferida epitelial começa em 1 dpi e termina em 3 dpi. A endoreplicação atinge picos de 2 dpi, o que é ideal para o ensaio edu (seção 4, Figura 2).
2. Dissecção abdominal de mosca
NOTA: Durante esta etapa, é importante evitar tocar o tecido abdominal ventral com as ferramentas de dissecção, pois comprometerá a integridade do epitélio.
- Obter todos os materiais necessários para dissecção: solução de graça, fórceps, Tesoura de Mola de Vanna, pinos de 0,10 mm, placas de dissecação de 9 poços, solução fixativa (4% paraformaldeído em 1x PBS), 1x PBS, lenços umedecidos, pipetas e dicas para 30 μm, e luvas (ver Tabela de Materiais).
- Confirme que as moscas foram feridas com sucesso por anesthetizar moscas feridas em uma plataforma de voo CO2sob um estereomicroscope e verificar a presença da cicatriz da ferida (ou seja, um ponto de melanina no abdômen, ver Figura 1B). Descarte quaisquer moscas do grupo experimental que não foram feridos com sucesso.
- Para começar a dissecção, encha um poço de um prato de dissecção de vidro de 9 poços com a solução de Grace. Use um par de fórceps para agarrar uma mosca fêmea ferida pelo lado dorsal do tórax e submergir a mosca no poço contendo a solução de Grace.
- Usando fórceps na mão oposta sem liberar o tórax, perfurar a cutícula dorsal abaixo do tergite A6 e puxar a cutícula da extremidade traseira da mosca da fruta. Os órgãos internos (ovário e intestino) geralmente saem nesta etapa. Se não, empurre suavemente o lado dorsal do abdômen com os fórceps para espremer os órgãos restantes e descartar em um poço vazio.
- Sole o abdômen completo na junção do tórax acima do tergite A2 usando os fórceps e transfira o abdômen para um poço vazio contendo ~100 μL da solução de Grace.
- Repita as etapas 2.3-2.5 até que todos os abdômens de mosca sejam dissecados.
- Reduza o volume da solução de Grace para 30 μL no poço contendo abdômens agrupados e dissecados.
- Filé os abdômens abertos posicionando o abdômen no lado dorsal com as fórceps em uma mão e, em seguida, inserindo a lâmina inferior da tesoura de mola de Vanna na cavidade abdominal com a outra mão. Corte ao longo da linha dorsal até que o abdômen esteja totalmente aberto, o que pode exigir até três cortes(Figura 1C, 1D).
- Configure uma placa de dissecação seca com quatro pinos de 0,10 mm por área de montagem abdominal. Cada placa de dissecação de 35 mm pode caber até sete áreas de montagem. Pipeta 30 μL da solução de Grace em cada área de montagem e transfira um abdômen preenchido para cada gota.
- Fixar os abdômens filés no prato nos quatro cantos dorsais(Figura 1E). Certifique-se de que o tecido está plano sem rasgar ou esticar o tecido abdominal.
- Para fixar o tecido, pipeta fora da solução da Grace e adicionar 30 μL da solução fixa ao abdômen preso.
ATENÇÃO: Use luvas enquanto manuseia a solução de correção, pois o paraformaldeído é tóxico. - Repita as etapas 2.10-2.11 até que todos os abdômens preenchidos sejam fixados na placa de dissecação.
- Coloque uma etiqueta de fita na parte inferior de cada prato para marcar cada controle e grupo experimental. Fixar amostras por 30-60 min em temperatura ambiente (RT).
- Lave a solução de correção por tubulação em 1,5 mL de 1x PBS para cada placa. Descarte a solução fixa e os plásticos em recipientes de resíduos químicos líquidos ou secos adequados de acordo com as diretrizes institucionais.
- Lave as placas 2x com 1,5 mL de PBS 1x e armazene tecido fixo coberto em 1,5 mL de PBS 1x em um recipiente plástico com tampa. Adicione uma camada de papel toalha úmida na parte inferior do recipiente e armazene amostras a 4 °C até ficar pronto para imunossumentar dentro de 1 semana de dissecção.
3. Imunofluorescência
- Preparem-se recentemente os reagentes (ver Tabela de Materiais): solução de tampão de lavagem (0,3% Triton X 100, 0,3% BSA em 1x PBS). O tampão de lavagem restante pode ser salvo a 4 °C e usado durante o protocolo de coloração de 2 dias. Prepare solução de anticorpos primários suficientes por ensaio(Figura 2) usando Anti-FasIII (1:50 mouse anti-Fasciclin-III) em tampão de lavagem com anti-Grh (1:300 affinity purificado coelho anti-Grainyhead8) ou anti-RFP (1:1.000 coelho anti-RFP). As soluções primárias de anticorpos podem ser salvas a 4 °C e reutilizadas várias vezes até que o sinal seja significativamente reduzido.
- Permeabilize tecido por pipetação de 1x PBS, adicionando 1,5 mL de tampão de lavagem, e incubando por pelo menos 30 minutos em um agitador orbital (80 rpm) na RT.
- Remova o tampão de lavagem e o tecido da mancha durante a noite com 1,5 mL de solução de anticorpos primários, incubando em um agitador orbital (80 rpm) a 4 °C. Colete a solução de anticorpos primários e economize em um tubo a 4 °C para experimentos futuros.
- Primeiro enxágüe a amostra rapidamente com 1x PBS e depois lave 3x com 1,5 mL de tampão de lavagem. Para cada lavagem, incubar amostras em RT em um agitador orbital por pelo menos 30 minutos.
- Durante a lavagem final, prepare a solução secundária de anticorpos: 1:1.000 burro anti-coelho Alexa 488 ou 568 e 1:1.000 anti-rato de cabra Alexa 488 ou 568 (ou fluoroforos de escolha) no tampão de lavagem.
- Remova o tampão de lavagem e os tecidos de manchas com 1,5 mL de solução de anticorpos secundários. Cubra amostras com papel alumínio e incubar em um agitador orbital na RT por 3 h. Alternativamente, as amostras podem ser incubadas durante a noite a 4 °C em um agitador orbital.
- Lave as amostras descartando primeiro a solução de anticorpos secundários e, em seguida, enxágue a amostra rapidamente com 1x PBS seguido de três lavagens com 1,5 mL de tampão de lavagem. Para cada lavagem, incubar amostras em RT em um agitador orbital por pelo menos 30 minutos.
- Prepare a solução DAPI diluindo o DAPI para 10 μg/mL no buffer de lavagem. Após a lavagem final, amostras de manchas com solução DAPI de 1,5 mL incubando em RT por 30 minutos.
- Descarte a solução DAPI e enxágue amostras 2x em 1,5 mL de 1x PBS. Armazene tecido manchado em 1,5 mL de 1x PBS no escuro, coberto com papel alumínio, a 4 °C até estar pronto para montar em um escorregador de vidro com deslizamento de tampa. A etapa de montagem deve ser realizada dentro de uma semana.
4. Atividade do ciclo celular (Ensaio EdU)
- Coma uma solução de estoque EdU de 10 mM do kit Click-iT (ver Tabela de Materiais) dissolvendo o pó EdU em dH20e misturando por ~15 min até dissolver completamente. A solução de estoque pode ser alitada (250 μL por tubo) e armazenada a -80 °C.
- A alimentação voa EdU diluindo primeiro o estoque de EdU para 5 mM em dH2O. Adicione levedura seca até que a solução esteja nublada e brevemente vórtice para misturar. Corte uma tampa de tubo de 0,5 mL e coloque-a no fundo do frasco de comida de mosca. Empurre a tampa para dentro da comida, por isso é estável.
- Anestesiar as moscas e transferir moscas de 3 a 5 dias para o frasco. Bata as moscas em uma borda para que nenhuma fique presa na tampa.
- Pipeta 75 μL de solução de levedura-EdU na tampa. As moscas devem ser alimentadas com solução fresca de levedura-EdU todos os dias e transferidas para um frasco de alimentos frescos com uma tampa a cada dois dias para garantir que as moscas não fiquem presas no fundo do frasco.
- Para transferir moscas, vire para um novo frasco com uma tampa, coloque moscas para dormir, toque moscas para um lado e adicione uma solução fresca de levedura-EdU.
- No terceiro dia, machuque as moscas e continue alimentando leveduras-EdU até a dissecação em 2 dpi(Figura 4A). Consulte a seção de protocolo 2 para métodos de dissecção e fixação.
- Prepare os reagentes de coloração edu: tampão de lavagem (0,3% Triton X 100, 0,3% BSA em 1x PBS), tampão de permeabilização (0,5% Triton X 100 em 1x PBS), tampão de bloqueio (3% BSA em 1x PBS) e preparar reagentes do kit de ensaio da EdU (ver Tabela de Materiais),incluindo tampão de reação 1x e aditivo tampão de reação 1x conforme indicado pelo fabricante.
- Lave amostras por 1h, misturando em RT em 1,5 mL de tampão de lavagem.
- Adicione 1,5 mL de tampão de permeabilização e incuba amostras por 20 minutos.
NOTA: Descongele e prepare a solução do coquetel de reação usando um volume de 500 μL/placa. - Lave amostras 1x rapidamente com 1x PBS e depois 3x rapidamente com 1 mL de tampão de bloqueio.
- Pipeta fora de todos os tampões de bloqueio restantes e adicionar 500 μL de solução de coquetel de reação por placa. Placas giratórias para garantir que os tecidos estejam completamente cobertos. Incubar em uma gaveta no escuro por 1 h no RT.
- Lave as amostras 1x rapidamente com 1,5 mL de tampão de bloqueio.
- Coloribile com 1,5 mL de solução DAPI a 1:5.000 em tampão de lavagem por 30 minutos.
- Lave 2x com 1x PBS rapidamente, enrole em papel alumínio e guarde no escuro a 4 °C até estar pronto para montar amostras dentro de 3 dias.
5. Montar tecido manchado
- Obtenha todos os materiais necessários para montagem: lâminas de vidro, tampas de vidro, esmalte claro, mídia de montagem, um par de fórceps e lenços umedecidos.
- Para montar tecido de mosca manchado, unpin abdômens da placa dissecando usando fórceps sob o estereóscópio. Transfira o tecido para ~30 μL de mídia de montagem em uma mancha de vidro, agarrando suavemente o tecido com fórceps pelos flancos dorsais, tomando cuidado para evitar tocar na área ventral com fórceps.
- Sob o estereomicroscope orientar o tecido abdominal de modo que o interior esteja voltado para baixo em direção ao deslizamento (ou seja, a cutícula externa/cerdas estão viradas para cima). Puxe os abdômens orientados para a borda da gota de mídia usando os fórceps. A tensão superficial ajudará a manter o tecido plano(Figura 1F).
NOTA: É útil para a imagem organizar os abdômens em uma coluna ou linha nesta fase. - Rotule um slide de vidro (ou seja, controle ou experimental) e pegue o deslizamento de tampas lentamente aproximando o slide da tampa. Vire deslize e limpe suavemente com uma limpeza para remover o excesso de mídia de montagem.
- Sele as bordas do deslizamento com esmalte claro e repita para todos os grupos experimentais restantes. Armazene slides em uma caixa de slides a 4 °C até ficar pronto para a imagem.
6. Imagem e processamento
- Imagem da área da ferida abdominal mosca localizando pela primeira vez a cicatriz de melanina com um microscópio confocal(Figura 1B), seja um scanner de ponto ou uma iluminação estruturada (ApoTome) com um óleo de 40x ou objetivo seco.
- Verifique a exposição em cada canal, garantindo que o sinal esteja abaixo da saturação. As configurações de imagem devem ser baseadas no grupo amostral mais brilhante. Isso é particularmente importante para a análise de ploidy, pois o canal DAPI precisa permanecer na faixa linear para medir com precisão o conteúdo do DNA.
- Pegue uma imagem completa de pilha z nos três canais com uma distância ótima de pelo menos 0,50 μm entre as fatias. Salve imagens capturadas e abra o arquivo no programa de análise de imagens Fiji (também conhecido como ImageJ).
- Para cada imagem, crie uma projeção de pilha de z usando a opção de fatias para todos os canais.
- Gire as imagens conforme necessário para garantir que os núcleos estejam alinhados horizontalmente através das imagens(Figura 3A e Figura 4E).
- Corte todas as imagens em uma seleção retangular de 300 μm x 300 μm centrada ao redor do local da ferida ou centro de controle ileso. Identifique a área desenhando um retângulo e selecionando Editar | Seleção | Especifique. Verifique se as unidades dimensionadas estão em mícrons para garantir que a mesma caixa de tamanho seja usada para todas as imagens a serem analisadas.
7. Análise de endoreplicação (ploidy)
- Usando Fiji, selecione a janela do canal Grh e duplique a imagem. Em seguida, use a ferramenta limiar para criar uma máscara. Ajuste manualmente o limiar deslizando a barra superior para minimizar o fundo sem fazer com que os núcleos encolham drasticamente(Figura 4D).
- Se algum núcleo no canal Grh estiver tocando na imagem limiar, use a ferramenta paintbrush (largura de 2 pixels) na mesma cor do fundo, para desenhar uma linha entre os núcleos. Clique para aplicar 1x quando terminar para gerar a máscara final.
- Gere um mapa de região de interesse (ROI) usando a função Analisar partículas: definir o tamanho para 5 μm-60 μm, a fim de capturar a maioria dos núcleos sem incluir o fundo.
- Ajuste manualmente do mapa do ROI conforme necessário no gerenciador de ROI. Exclua todas as seleções que não sejam núcleos e adicione quaisquer núcleos à lista que não foram identificados delineando o núcleo com a ferramenta de seleção à mão livre e adicionando-o ao gerenciador de ROI (Figura 4D).
- Selecione o canal DAPI e clique em Mostrar tudo no gerenciador de ROI para aplicar o mapa roi gerado no canal Grh no canal DAPI.
- Exclua quaisquer seleções onde o contorno dos núcleos epiteliais se sobreponha aos núcleos não siteliais (por exemplo, núcleos de músculo ou gordura) do mapa roi. O cabeça-de-biliésima só mancha núcleos epiteliais, enquanto o DAPI mancha todos os núcleos. Verifique se cada seleção delineada contém apenas um núcleo e exclua ou edite quaisquer seleções com mais de um núcleo. Salvar a lista de ROI editados.
- Meça a área e a densidade integrada de cada núcleo epitelial no mapa do ROI usando as ferramentas de análise em Fiji. Exporte os valores para um programa de planilha.
- Meça o fundo médio da imagem usando a ferramenta de seleção circular. Desenhe três círculos que não se sobrepõem a nenhum núcleo em diferentes áreas da imagem DAPI. Adicione a área e a densidade integrada de cada um dos círculos a um programa de planilha para estabelecer o brilho da imagem em segundo plano.
- Comece calculando o fundo médio por unidade de cada imagem, dividindo cada valor de densidade integrada de fundo por sua área correspondente. Em seguida, média das três medições integradas por área para a imagem, a fim de obter o fundo médio por unidade área.
- Em seguida, calcule o fundo total de cada núcleo DAPI multiplicando a área do núcleo pelo fundo médio por área unitária. A intensidade de DAPI normalizada para cada núcleo medido pode então ser calculada subtraindo o fundo total de cada núcleo a partir de sua densidade integrada medida.
- Em média, todos os valores de intensidade de DAPI normalizados do controle epitelial ileso. Os núcleos epiteliais não feridos foram previamente calculados para ter um valor ploidy de 2C e podem servir de referência para o cálculo da ploidia nos núcleos epiteliais a partir das condições experimentais8.
- Calcule a ploidia de cada núcleo dividindo a intensidade do DAPI normalizado de cada núcleo pelo valor normalizado do controle epitelial não ferido de referência (2C), em seguida, multiplique o valor por 2 para igualar a ploidia normalizada (valor C):
(Densidade Integrada Nuclear - Densidade Integrada Nuclear de Fundo)/Densidade Integrada Nuclear Média (núcleos epiteliais não feridos = 2C) x 2 = ploidia nuclear epitelial (C) - Núcleos gráficos com valores ploidy como um gráfico de pontos, histograma ou agrupados em um gráfico de barras em conformidade (ou seja, 2C [0.6-2.9C], 4C [3.0-5.9C], 8C [6.0-12.9C], 16C [13.0-24.9C], e >32C [>25.0C](Figura 3F).
Representative Results
Um protocolo detalhado é fornecido para usar D. melanogaster como modelo para estudar poliploidização induzida por feridas (WIP). Este modelo de cura de feridas fornece muitas vantagens sobre os mamíferos e outros modelos de moscas de WIP. A poliploide foi facilmente induzida por uma punção mecânica com um pino de inseto e células poliploides foram geradas em um curto período de tempo (2-3 dpi) (Figura 1A, 1B)4. O maior desafio é a dissecção do tecido abdominal intacto sem perturbações ao epitélio. O epitélio D. melanogaster é facilmente acidentalmente esbarrado ou arranhado com as ferramentas de dissecção afiadas. Portanto, as etapas deste protocolo devem ser praticadas antes do uso e análise.
Primeiro, a lesão foi restrita ao abdômen feminino ventral, que fornece uma grande área de tecido opaco plana ideal para imagem. As perfurações foram infligidas no epitélio pleurito, que fica em ambos os lados dos sternites de linha média ventral e direcionado entre os segmentos tergite (T) T4-T5(Figura 1A-C). Esta colocação da ferida fornece uma grande área visível que não é interrompida pela dissecção. As etapas desafiadoras incluem o corte da tesoura da mola abdominal e os passos de fixação(Figura 1D, 1E). A etapa de corte da mola funcionou melhor quando os abdômens foram cortados em um volume reduzido da solução de Grace (~30 μL) para diminuir o movimento do tecido. Um corte bem centrado ao longo da linha média dorsal foi necessário para fornecer área suficiente nos retalhos dorsais abdominais para fixar aberto na placa de dissecção(Figura 1C). O abdômen deve ser fixado suavemente nos quatro cantos sem força excessiva(Figura 1E). Um empurrão de pino que é muito duro distorcerá o tecido abdominal e pode até empurrar o tecido para dentro da placa de dissecção. Se isso acontecer, o tecido deve ser descartado. Uma vez fixado o tecido abdominal, permaneceu na placa de dissecção até que a coloração da imunofluorescência estivesse completa e os abdômens fossem montados em uma tampa de vidro para imagem(Figura 1F).
A cicatrização da ferida requer uma folha epitelial contínua para formar, que depende da endoreplicação e fusão celular4,16. A proteína de junção de septate FasIII, que rotula junções células-células, forneceu um indicador para saber se alguma perturbação de processamento ocorreu durante a preparação(Figura 1G, 1H). Abdômens com grandes arranhões (área não manchada) que perturbam a área da ferida devem ser descartados e não foram utilizados para análise suplementar(Figura 1H).
O passo seguinte foi analisar amostras intactas para quaisquer defeitos em WIP. Este protocolo inclui ensaios distintos para detectar diferentes aspectos da resposta WIP(Figura 2). O reparo da ferida foi concluído quando uma célula central, grande e multinucleada cobriu a cicatriz da ferida(Figura 3A). Aqui a fusão celular foi detectada pela coloração para FasIII/Grh e quantificando o número de grh+ núcleos epiteliais englobados na área de fasIII delineada4. Defeitos no fechamento da ferida ou re-epitelialização foram detectados quando foram observadas lacunas de >10 μm na folha epitelial(Figura 3B, seta vermelha). Foi o caso, por exemplo, quando a WIP foi inibida pela ativação do ciclo mitótico via expressão de STG, fzrRNAi, conforme relatado recentemente16. Nesta condição genética, 52% das feridas não foram capazes de formar uma folha epitelial contínua sobre a cicatriz da ferida(Figura 3B, 3C).
Outro método para medir o reparo da ferida neste modelo foi visualizando a membrana epitelial com expressão epi-Gal4 de UAS-mCD8-ChRFP4 (Figura 2, Figura 3D). No controle, 91% das feridas epiteliais fecharam completamente por 3 dpi, mas inibindo a eliminação por meio do bloqueio da endoreplicação(E2f1RNAi) e da fusão celular(RacDN)simultaneamente, como relatado anteriormente, fez com que 92% das feridas epiteliais permanecessem completamente abertas (Figura 3D, 3E)8,16. A ativação do ciclo celular mitotístico por expressão de stg, fzrRNAi também resultou em um defeito de fechamento da ferida epitelial. No entanto, ao visualizar a membrana celular epitelial, a extensão do defeito de re-epitelialização poderia ser determinada. As feridas de moscas do mutante WIP(E2f1RNAi, RacDN) estavam mais abertas do que as feridas de stg, fzrRNAi (Figura 3D,contorno vermelho tracejado)16. Este ensaio de cicatrização da ferida da membrana forneceu mais informações sobre a extensão do defeito de reparação da ferida. Como resultado, os defeitos de re-epitelialização poderiam ser agrupados como completamente abertos, parcialmente fechados (ou seja, >10 μm gaps) ou completamente fechados(Figura 3D, 3E).
Além da fusão celular, as células epiteliais crescem em tamanho por endoreplicação, um ciclo celular incompleto que dobra o conteúdo do DNA nuclear. A endoreplicação foi avaliada tanto pela atividade do ciclo celular quanto pelas medidas diretas de ploidia do DNA nuclear(Figura 2 e Figura 4). Aqui, a atividade do ciclo celular foi detectada por incorporação do analógico timmidina, EdU (Figura 4A, 4B). D. melananetas foram encontradas células epiteliais para entrar no endociclo, um ciclo celular incompleto que oscila entre as fases S e G sem uma fase M intervenitivas4,12. A dieta de D. melanogaster adulta foi suplementada com EdU+ alimentos antes da lesão e as moscas foram mantidas em uma dieta EdU+ até dissecção a 2 dpi(Figura 4A). A EdU foi então detectada usando o protocolo Click-iT do fabricante. Este ensaio da EdU foi usado para determinar onde, quando e quantos núcleos foram acionados para entrar na fase S em resposta a uma ferida. Usando o sistema Gal4/ UAS, verificou-se recentemente que a expressão epitelial específica do micríaco pode bloquear (mycRNAi) ou exacerbar (superexpressão myc) a competência das células epiteliais para entrar na fase S. Como resultado, foi demonstrado que o Myc é suficiente para induzir a endoreplicação em células pós-médicos, mesmo sem lesão16,22.
Em seguida, a ploidia epitelial foi determinada pela medição direta do conteúdo de DNA nuclear. Os núcleos epiteliais foram identificados por coloração de imunofluorescência para o marcador específico epitelial, Grh (Figura 4D). No software de imagem fiji, núcleos epiteliais foram sistematicamente identificados e, em seguida, limiares usando mancha nuclear grh. Os núcleos foram então separados e os ROIs sobrepostos à soma de pilhas imagem DAPI(Figura 4D, arqueiro verde). Quaisquer núcleos sobrepostos foram excluídos manualmente antes da densidade integrada dos núcleos selecionados ser medida(Figura 4D, setas vermelhas). Este método semiautomado permite quantificar a distribuição e ploidy da maioria dos núcleos em todo o epitélio abdominal mosca não ferido e reparado8. Como relatado recentemente, os núcleos epiteliais em torno da ferida foram compostos por núcleos poliploides de 44% com conteúdo de DNA superior a 3C a 3 dpi(Figura 4E, 4F)16. Como esperado dos resultados da EdU, o knockdown do micró levou a um bloco significativo na endoreplicação, pois apenas 9% dos núcleos epiteliais eram poliploides, enquanto a superexpressão do Myc resultou em núcleos epiteliais 100% poliploides ao redor do local da ferida(Figura 4F)16. O tamanho nuclear epitelial também foi visivelmente afetado pela expressão mística com núcleos reduzidos ou ampliados presentes. No entanto, a área nuclear não é uma medida precisa da ploididade e dos efeitos fisiológicos, pois fatores como o alongamento celular também podem influenciar o tamanho nuclear sem afetar o conteúdo do DNA nuclear20.
Figura 1: Frutas adultas voam feridas abdominais, dissecação e montagem tecidual. Diagramado ensaio de ferida abdominal adulto. As moscas devem ser feridas em ambos os lados do abdômen no tergite 4 (T4). (B) Fruta fêmea adulta voar 3 dpi com crosta de melanina formada a partir da cicatriz da ferida (caixa branca). Barra de escala = 50 μm. (C) Abdômen adulto dissecado, vista dorsal, com tergites rotulados. Os abdômens foram preenchidos pela linha média do lado dorsal (linha branca tracejada). Barra de escala = 50 μm. (D) Abdômen adulto dissecado e preenchido antes da fixação. Barra de escala = 50 μm. (E) Abdômen adulto fixado em uma placa de dissecação. Um pino foi colocado em cada um dos quatro cantos do abdômen no lado dorsal. O tecido foi gentilmente aberto, mas não esticado, para evitar rasgos. (F) Os abdômens adultos foram montados e colocados em uma mancha de vidro com o interior do abdômen voltado para baixo em direção ao deslizamento de tampas e cutícula orientadas para o deslizamento de vidro. (G) Mancha fasIII de área de ferida intacta sem perturbação de processamento e um siníntio central (linha amarela tracejada). Barra de escala = 50 μm. (H) Imagem de uma área de ferida arranhada (*) com uma região de FasIII não manchada que interrompe o siníntio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Fluxo de trabalho de análise wip. O fluxograma retrata os três ensaios descritos neste estudo e etapas sobrepostas e distintas para detectar e medir a resposta wip. O ensaio EdU mede a atividade do ciclo celular (caixas azuis), ploidia e re-epitelialização são detectados pela imunostaining Grh/FasIII (caixas verdes), e a expressão da membrana RFP permite medir a extensão do fechamento da ferida epitelial (caixas cor-de-rosa). Os passos comuns estão em caixas cinza e os genótipos de cepa D. melanogaster estão listados acima. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Métodos para detectar a re-epitelialização durante a WIP. A re-epitelialização foi perturbada quando a WIP foi geneticamente inibida. Imagens imunofluorescentes de controle (A) e stg, fzrRNAi (B)a 3 dpi. Núcleos epiteliais e junções septate foram manchados com Grh (verde) e FasIII (magenta), respectivamente. (A' e B') Só a coloração fasIII mostrou que a re-epitelialização foi prejudicada (seta vermelha) no epitélio fzrRNAi. Barra de escala = 50 μm. (C) Quantificação de defeitos de re-epitelialização (%) a 3 dpi (cinza): controle (n = 8), stg, fzrRNAi (n = 6). As barras de erro indicam erro padrão; a significância estatística foi medida via teste T do Aluno, **P < 0,01. A re-epitelialização durante o reparo da ferida também pode ser detectada pela expressão de uma membrana ligada rfp usando epi-Gal4, UAS-mCD8-RFP. (D) Imagens imunofluorescentes de controle, E2F1RNAi,RacDN, e stg, fzrRNAi a 3 dpi. Barra de escala = 20 μm. Cicatriz da ferida (contorno amarelo) e área de ferida epitelial aberta (contorno vermelho). (E) Quantificação do fechamento da ferida em ctrl (n = 11), E2F1RNAi, RacDN (n = 13), e stg, fzrRNAi (n = 13). Adaptado de Grendler et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Métodos para detectar a endoreplicação durante a WIP. (A) Linha do tempo do ensaio edu: Drosophila adulto foram alimentados com 75 μL de levedura de 5 mM-EdU todos os dias 2 dias antes da lesão e continuou até 2 dpi. (B) Imagens imunofluorescentes do rótulo EdU em cepas de mosca expressas com sistema epi-Gal4/ UAS a 2 dpi. Cicatriz de ferida (W). Barra de escala = 50 μm. (C) Número médio de núcleos epiteliais EdU+ por mosca a 2 dpi: ctrl (n = 37), mycRNAi#1 (n = 10) e Myc (n = 8). As barras de erro indicam erro padrão; a significância estatística foi medida via Teste T do Estudante, *P < 0,05, **P < 0,01. (D) Esquema de detecção e medição da ploidia nuclear epitelial. Núcleos epiteliais foram identificados e limiares pela mancha anti-Grh em Fiji. Núcleos epiteliais sobrepostos foram separados (pontas de flecha verde) ou removidos (pontas de flecha vermelha) se sobrepostos por núcleos não espitelais. A densidade integrada e a área nuclear da imagem dos núcleos manchados do DAPI foram medidas. (E) O tamanho nuclear epitelial (Grh) foi alterado pela expressão myc em 3 dpi. (F) Ploidia nuclear epitelial (%) em 3 dpi: ctrl (n = 4), mycRNAi#1 (n = 6) e Myc (n = 3). Adaptado de Grendler et al.16. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Apresentado é um protocolo detalhado sobre como dissecar e usar o epitélio abdominal D. melanogaster adulto para estudar como os genes regulam a WIP alterando a re-epitelialização e a endoreplicação durante o reparo da ferida16. Usando este método, o proto-oncogene Myc foi recentemente identificado como um regulador-chave da WIP. Myc é necessário para que as células epiteliais se acabem após a lesão e é suficiente para que as células epiteliais quiescentes endocicem tanto no epitélio mosca adulto quanto nas glândulas acessórias16,22. Verificou-se também que a troca de células epiteliais para um ciclo celular mitótico por expressão de stg, fzrRNAi é prejudicial ao reparo da ferida. Estudos contínuos usando este método identificarão outros genes necessários para regular a re-epitelialização e a endoreplicação durante a ELIMINAÇÃO, revelando semelhanças e diferenças na forma como a polipoide é regulada e funciona em uma variedade de tecidos.
Este modelo e método oferecem vantagens únicas, incluindo a fácil indução de poliploide com punção mecânica e o fato de que as células poliploides são geradas dentro dos dias4. Os protocolos de dissecção e preparação tecidual são baseados nas técnicas de dissecçãolarval 23,mas o abdômen de mosca adulto é mais rígido e, portanto, facilmente perturbado. Como resultado, este protocolo requer prática e precisão para isolar um tecido intacto para estudar WIP. Uma vez dissecado, no entanto, o epitélio é claramente visível e facilmente imageado, produzindo um instantâneo do processo de cicatrização da ferida. Este método fornece uma riqueza de informações sobre a organização epitelial da mosca adulta, tamanho celular e sincronia, e a ploidia de células e núcleos individuais. Embora a imagem ao vivo ainda não seja possível dentro da mosca de frutas intactas devido à sua cutícula opaca, este protocolo poderia ser adaptado para incluir atualmente disponíveis condições de cultura ex vivo usadas em D. melanogaster para realizar estudos de imagem ao vivo de curto prazo24.
No futuro, este modelo será ideal para estudar o crosstalk célula-celular e a contribuição de outros tipos de células para o WIP, regulando a expressão genética com o sistema Gal4/UAS em outros tipos de interesse celular. Perguntas semelhantes também podem ser respondidas usando uma variedade de origens genéticas e mutantes. O abdômen de mosca adulto dissecado contém uma variedade de tipos celulares que podem ser facilmente visualizados usando este método, incluindo corpo gordo e oenócitos, fibras musculares laterais, neurônios sensoriais, traqueia e hemócitos semelhantes a macrófagos. Além disso, esse modelo permitirá que os pesquisadores investiguem como as variáveis fisiológicas influenciam a MML, incluindo sexo, dieta, infecção, idade e estressores ambientais. Enquanto o protocolo usa a mosca fêmea adulta devido ao seu tamanho maior, wip também ocorre na mosca de frutas machos (Gjelsvik e Losick, inédito). Células poliploides têm surgido durante o envelhecimento e doença associada à idade no fígado, cérebro, olho e coração12mamíferos . O modelo de mosca-das-frutas permitirá que os pesquisadores estudem a poliploidização em contextos fisiológicos e de doenças, porque os genes relacionados à doença humana são altamente conservados.
Disclosures
Nenhum.
Acknowledgments
No Boston College, gostaríamos de agradecer ao Dr. Eric Folker pelo uso da instalação de microscópio de câmera e estereoscópio de seu laboratório para imagem e Bret Judson no Boston College Imaging Core por infraestrutura e suporte. Também gostaríamos de agradecer aos recursos da comunidade de moscas: Bloomington Drosophila Stock Center (NIH P40OD018537), Vienna Drosophila Resource Center e TRiP Center na Harvard Medical School (NIH/NIGMS R01-GM084947) por fornecer estoques transgênicos usados neste estudo. O anticorpo FasIII do rato foi obtido do Developmental Studies Hybridoma Bank apoiado pelo NICHD do NIH e mantido na Universidade de Iowa, Departamento de Biologia, Iowa City, IA. A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o Prêmio Número R35GM124691. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875713 | For creating plates to dissect in |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | For preparing staining reagents in |
| AxioImager M2 with Apotome | Zeiss | NA | For imaging samples |
| Blowgun mini | Genesee Scientific | 54-104M | For anethesizing D. melanogaster strains |
| Bovine Serum Albumin, 30% | Sigma | A7284-500ML | For immuostaining |
| Carbon dioxide tank | various distributors | N/A | For anethesizing D. melanogaster strains |
| Click-iT EdU 594 Kit | Thermofisher | C10339 | For EdU assay |
| Coverslips | Thermofisher | 3406 | For mounting |
| DAPI | Sigma | D9542-10MG | For immuostaining |
| Dissecting Plates (use Sylgard 184 Sil Elastic Kit) | Ellsworth Adhesives | 184SIL | For creating plates to dissect in. Mix epoxy as directed, let dry overnight |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermofisher | A21206 | For secondary immuostaining |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Thermofisher | A10042 | For secondary immuostaining |
| Drosophila tubing and fittings | Genesee Scientific | 59-124C, 59-123, 59-140 | For anethesizing D. melanogaster strains |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | For dissecting |
| epi-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b38793 | Losick et al. Current Biology, 2013 |
| epi-Gal4, UAS-mCD8.RFP | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b38793, b27392 | Losick et al. Current Biology, 2013 |
| Excel | Microsoft | For performing ploidy calculations | |
| Fiji/ImageJ (image analysis software) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij | For image analysis |
| Fly food | Archon Scientific | N/A | Corn Syrup/Soy food |
| Flystuff Flypad | Genesee Scientific | 59-114 | For anethesizing D. melanogaster strains |
| Glass dissecting dish | Fisher Scientific | 13-748B | For performing dissections in |
| Glass slides | Fisher Scientific | 12-518-104C | For mounting |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 conjugate | Thermofisher | A11001 | For secondary immuostaining |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 conjugate | Thermofisher | A11031 | For secondary immuostaining |
| Grace's Insect Medium, unsupplemented | Thermofisher | 11595030 | For dissecting in |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | For wounding and pinning fly abdomens flat |
| Mouse anti-Fasciclin III (Drosophila) Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 7G10 | For immunostaining epithelial cell-cell junctions |
| Mouting media | Vector Laboratories | H-1000 | Anti-fade mounting media to prevent photo bleaching during imaging |
| Nail polish | Electron Microscopy Sciences | 72180 | For sealing slides |
| Ortibal shaker | Fisher Scientific | 02-217-988 | For immuostaining |
| Phosphate Buffered Saline, PH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | For staining |
| Pin holders | Fine Science Tools | 91606-07 | For wounding |
| Rabbit anti-Grainyhead Primary Antibody | N/A | N/A | For immunostaining epithelial nuclei. Protocol to make antibody can be found (Ref. #4 and 8) |
| Rabbit anti-RFP Primary Antibody | MBL | PM005 | For immunostaining mCD8-RFP fly epithelium |
| Stereomicroscope | Olympus | SZ51 | For dissecting and mounting fly tissue |
| Triton X-100 | Sigma | 10789704001 | For immuostaining |
| UAS-E2F RNAi, UAS-RacDN | VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) | v108837, b6292 | Losick et al. Current Biology, 2013 |
| UAS-fzr RNAi, UAS-Stg | VDRC (v) and Bloomington Drosophila Stock Center (b) | v25550, b56562 | Grendler et al. Development, 2019 |
| UAS-Myc | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b9674 | Grendler et al. Development, 2019 |
| UAS-myc RNAi | Bloomington Drosophila Stock Center (b) | b36123 | Grendler et al. Development, 2019 |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | For dissecting |
References
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