Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Изображение и анализ нейрофиламента транспорта в акцизных мышь Tibial нерва

Published: August 31, 2020 doi: 10.3791/61264
Automatic Translation
1, 1,2, 3,4, 1
1Department of Neuroscience, The Ohio State University, 2Present address: Interdepartmental Neuroscience Graduate Program and Department of Neurobiology, Northwestern University, 3Quantitative Biology Institute, Ohio University, 4Department of Physics and Astronomy, Ohio University

Summary

Мы описываем методы флуоресценции фотоактивации для анализа аксонального переноса нейрофилаций в одиночных миелинированных аксонах периферических нервов от трансгенных мышей, которые выражают фотоактивируемый белок нейрофиламента.

Abstract

Нейрофиламентные белковые полимеры перемещаются по аксонам в медленном компоненте аксонального транспорта со средней скоростью 0,35-3,5 мм в день. До недавнего времени изучение этого движения на месте было возможно только с помощью радиоизотопного пульсового маркировки, что позволяет анализировать аксональный транспорт в целых нервах с временным разрешением дней и пространственным разрешением миллиметров. Для изучения нейрофиламента транспорта на месте с более высоким висовым и пространственным разрешением, мы разработали hThy1-paGFP-NFM трансгенной мыши, которая выражает нейрофиламент белка M помечены фотоактивируемым GFP в нейронах. Здесь мы описываем флуоресценции фотоактивности пульс-побег и импульс-распространения методов для анализа нейрофиламента транспорта в одной миелинированной аксонов тибиальных нервов от этих мышей ex vivo. Изолированные сегменты нерва поддерживаются на стадии микроскопа перфузией с кислородом солевым раствором и изображения спиннинг диска конлокальной флуоресценции микроскопии. Фиолетовый свет используется для активации флуоресценции в коротком аксональном окне. Флуоресценция в активированных и фланговых областях анализируется с течением времени, что позволяет изучить транспортировку нейрофиламента с висовым и пространственным разрешением на порядок минут и микрон, соответственно. Математическое моделирование может быть использовано для извлечения кинетических параметров нейрофильтра транспорта, включая скорость, направленность и приостановощающее поведение из полученных данных. Методы пульса-побега и пульс-распространения также могут быть адаптированы для визуализации нейрофильтрамента транспорта в других нервах. С развитием дополнительных трансгенных мышей, эти методы могут также быть использованы для изображения и анализа аксональная транспорт других цитоскелетных и цитозолических белков в аксонах.

Introduction

Аксональный транспорт нейрофиламентов был впервые продемонстрирован в 1970-х годах радиоизотопной пульсовой маркировкой1. Этот подход дал огромное количество информации о нейрофильтра транспорта in vivo, но он имеет относительно низкий пространственный и временное разрешение, как правило, на порядок миллиметров и дней в лучшем случае2. Кроме того, радиоизотопная маркировка пульса является косвенным подходом, который требует инъекций и жертвоприношения нескольких животных для создания единого временного курса. С открытием флуоресцентных белков и достижений в флуоресценции микроскопии в 1990-х годов, впоследствии стало возможным изображение нейрофильтра транспорта непосредственно в культивируемых нейронов на шкале времени секунд или минут и с суб-микрометрового пространственного разрешения, предоставляя гораздо больше понимания механизма движения3. Эти исследования показали, что нейрофиламентные полимеры в аксонах быстро и периодически перемещаются как в антероградных, так и в ретроградных направлениях вдоль микротрубочек, движимых микротрубочками моторных белков. Тем не менее, нейрофиламенты дифракционно-ограниченные структуры всего 10 нм в диаметре, которые, как правило, расположены отдельно от своих соседей только на десятки нанометров; Таким образом, полимеры могут быть отслежены только в культивируемых нейронов, которые содержат редко распределенных нейрофиламентов, так что движущиеся полимеры могут быть решены от своих соседей4. Таким образом, в настоящее время невозможно отследить одиночные нейрофиламенты в аксонах, которые содержат обильные полимеры нейрофиламента, такие как миелинизированные аксоны.

Для анализа аксональной транспортировки нейрофилаций в нейрофиламент богатых аксонов с использованием флуоресценции микроскопии, мы используем флуоресценции фотоактивности импульс-побег метод, который мы разработали для изучения долгосрочного паузы поведение нейрофилаций в культивируемых нервных клеток4,5. Нейрофиламенты, помеченные фотоактивируемым флуоресцентным нейрофильтрным синтезом белка, активируются в коротком сегменте аксона, а затем скорость отхода этих нитей из активированной области количественно измеряется путем измерения флуоресценции распада с течением времени. Преимуществом такого подхода является то, что это анализ нейрофильтрации на уровне населения, который может применяться в времени минут или часов без необходимости отслеживать движение отдельных полимеров нейрофиламента. Например, мы использовали этот метод для анализа кинетики нейрофильтрации транспорта в миелинирующих культур6.

Недавно мы описали развитие hThy1-paGFP-NFM трансгенной мыши, которая выражает низкий уровень paGFP-тегами нейрофильтр белка M (paGFP-NFM) в нейронах под контролем человека нейрон-специфический Thy1 промоутер7. Эта мышь позволяет анализировать нейрофильтр транспортировки на месте с помощью флуоресценции микроскопии. В этой статье мы описываем экспериментальные подходы для анализа нейрофильтра транспорта в миелинированных аксонов тибиальных нервов от этих мышей с использованием двух подходов. Первый из этих подходов является описанным выше методом пульс-побега. Этот метод может генерировать информацию о приостановке поведения нейрофиламентов, но слеп к направлению, в котором нити отходят от активированной области, и, следовательно, не позволяет измерить чистую направленность и скорость транспортировки8. Второй из этих подходов представляет собой новый метод пульса распространения, в котором мы анализируем не только потерю флуоресценции из активированного региона, но и переходное увеличение флуоресценции в двух фланговых окнах, через которые перемещаются флуоресцентные нити при отходе от активированной области как в ангерозном, так и в ретроградном направлениях. В обоих подходах такие параметры нейрофильтра, как средняя скорость, чистая направленность и приостановление поведения, могут быть получены с помощью математического анализа и моделирования изменений флуоресценции в измерительных окнах. Рисунок 3 иллюстрирует эти два подхода.

Этот протокол демонстрирует вскрытие и подготовку нерва, активацию и визуализацию флуоресценции paGFP, а также количественную оценку транспортировки нейрофиламента из приобретенных изображений с использованием пакета распределения FIJI ImageJ9. Мы используем тибиальный нерв, потому что он длинный (несколько см) и не ветвиется; однако, в принципе любой нерв, выражаюющий paGFP-NFM подходит для использования с этой техникой, если он может быть рассечен и де-шейт без повреждения аксонов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все методы, описанные здесь, были одобрены Институциональным комитетом по уходу и использованию животных (IACUC) Университета штата Огайо.

1. Приготовление нервного солевого раствора

  1. Сделать 100 мл солевого раствора Брейера10: 98 мМ NaCl, 1 мМ ККл, 2 мМ КХ2PO4, 1 мМ MgSO4, 1,5 мМ CaCl2, 5,6% D-глюкозы, 23,8 мМ NaHCO3 в двойной диготированной воде.
  2. Пузырь 95% кислорода / 5% углекислого газа (карбоген) через солевой раствор, по крайней мере 30 минут до использования. Оставшийся солевой раствор можно повторно разысысыть в течение одной недели; однако, он должен быть reoxygenated перед каждым использованием.
  3. Налейте кислородом солевой раствор в шприц 60 мЛ и убедитесь, что в шприце остается минимальный воздух.

2. Первоначальная сборка камеры перфузии нерва

  1. Подключите шприц и трубки, как показано на рисунке 1A,помещая трубку оттока в колбу с отходами.
  2. Поместите внешнюю прокладку в корпус камеры перфузии, гарантируя, что входные и выходные столбы выровнены с отверстиями в прокладке.
  3. Положите внутреннюю прокладку (силикон, 100 мкм толщиной) на #1,5 круговой крышкой (диаметр 40 мм), тщательно разглаживая любые морщины в прокладке, чтобы обеспечить плотное уплотнение. Чтобы облегчить более поздную сборку, поместите крышку и прокладку на бумажное полотенце или салфетку задачи с прокладкой вверх.

3. Рассечение и подготовка мыши tibial нерва

  1. Пожертвование животного путем вдыхания углекислого газа или другого институционально утвержденного метода. Запустите таймер, когда животное перестает движение / дыхание, как эксперименты должны быть проведены только в течение 3 часов после жертвоприношения7.
  2. Спрей меха с 70% этанола и удалить как можно больше из ног животного и обратно с помощью электрической бритвы.
  3. Используя пару больших ножниц вскрытия, сделать спинной разрез в коже вблизи середины позвоночника и продолжить разрез вокруг брюшной аспект животного. Начиная с этого разреза, медленно отражают кожу от ног, осторожно потянув его от мышцы и резки фасции.
  4. Поместите животное в положение на спине на подносе для вскрытия и прикрепите все четыре лапы. Опционально прикрепите хвост, чтобы уменьшить движение дальше.
  5. Используя микродисциссу ножницы, сделать разрез в мышцах бедра на полпути между хвостом и коленом, чтобы разоблачить седалищного нерва. Убедитесь, что нерв, который виден через мышцы, не разрезается.
  6. Продлите разрез спинно и в желудочно, чтобы удалить мышцу. Аналогичным образом, удалить мышцы теленка, сохраняя порезы мелкой и короткой, чтобы избежать повреждения нерва.
  7. Удалите мышцы до тех пор, пока tibial нерв полностью подвергается от точки, где он ветвиется от седалищного нерва (на колене) к пятке (Рисунок 2A).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Во всех шагах, включая и после вскрытия тибиального нерва, избежать ненужного воздействия окружающего света, чтобы свести к минимуму возможные случайные активации paGFP в нерве.
  8. Возьмитесь за тибиальный нерв на позвоночник-проксимальный конец с парой щипцов и сократить нерв с помощью пары ножниц микродиссекции. Заботясь, чтобы не ставить напряжение на нерв, поднять его от мышцы, резки любых вложений.
  9. Вырезать позвоночника дистального конца тибиального нерва и передачи в небольшой петри блюдо комнатной температуры кислородом солевого раствора. С этого момента в процедуре, всегда будьте уверены, чтобы отслеживать проксимальные и дистальные концы нерва.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Один из способов сделать это, чтобы отметить дистальный конец нерва с угловым вырезать так, что конус виден.
  10. Начиная с проксимального конца нерва, осторожно схватить подвергаются аксон заканчивается с парой очень тонкой наконечником щипцами.
  11. Со второй парой щипцов, схватить нерва шейт проксимально, и медленно тянуть к дистальному концу нерва. Нервная шея будет скользить по аксонам с минимальным сопротивлением. Убедитесь, что во время этого процесса не применяется неоправданное напряжение к нерву.

4. Окончательная сборка камеры перфузии нерва

  1. Схватив проксимальный конец нерва, удалите его из солевого раствора и медленно положите его на крышку перфузионной камеры в прямоугольном открытии внутренней прокладки, сохраняя нежное напряжение на нерве, как вы кладете его так, что он лежит прямо.
  2. Поместите слайд микроакавека над нервом с рифленой стороной, обращенной к нерву, и направление потока параллельно нерву. Переверните крышки и сборку микроакевовки более, и поместите его в корпус камеры перфузии с микроакудук слайда apposed к внешней прокладке. Нерв и окружающие внутренние прокладки теперь будут зажаты между крышкой и слайдом микроакуда, которые разделены прокладкой, с крышкой лицом вверх (Рисунок 1B).
  3. Защитите перфузионную камеру, поместив ее в металлическое корпус и вращая кольцо блокировки. Убедитесь, что пластиковый корпус полностью под все металлические зажимы и затяните хорошо, чтобы предотвратить утечку солевого раствора. Чрезмерное укрепление может взломать слайд микроакудадук или крышку. Переверните камеру так, чтобы крышка была обращена вниз.
  4. Медленно угнетайте солевой шприц поршень, чтобы заполнить перфузионную камеру. Держите вход и розетку трубки, розетки колбы и шприц повышенной над самой камерой во все времена во время установки и изображения. Это позволяет избежать сифонирования, которое может привести к увеличению концентрации внимания или вызвать нестабильность фокуса из-за негативного давления в камере.
  5. Перенесите сборку перфузии на перевернутую стадию микроскопа и установите солевой шприц в шприц-насос. Запустите двигатель с соответствующей скоростью при скорости потока 0,25 м/мин. Затем подключите и включите в строке нагреватель решения установлен до 37 градусов по Цельсию.
  6. Соедините объективный обогреватель и установите до 37 градусов по Цельсию, нанесите масло на цель и вставьте камеру перфузии в сценическое крепление.
  7. Нанесите масло на площадку камерного обогревателя и прикрепите к перфузионной камере. Подключите и включите камерный обогреватель; установлено до 37 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изменения температуры могут привести к формированию пузырьков в перфузионной камере из-за outgassing раствора. Если образуются пузырьки, ненакратить скорость потока раствора на 5-10x до тех пор, пока пузырьки не очистит камеру.
  8. Заблокируйте камеру перфузии в адаптер сцены и принесите объективное масло в контакт с крышкой на нижней стороне камеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Камера Bioptechs с адаптером ASI, используемым здесь, предназначена для перевернутой конфигурации микроскопа.

5. Активация флуоресценции и приобретение изображений

  1. Используя яркое освещение поля, сосредоточьтесь на слое аксонов на нижней поверхности нерва, ближайшего к поверхности крышки(рисунок 2B). Миелиные аксоны (обычно 1 - 6 мкм в диаметре у взрослых мышей) могут быть идентифицированы по наличию миелиновой оболочки, которая видна под ярким световым освещением без контрастного повышения. Также очевидны расщелины Шмидта-Лантермана и узлы Ранвье. Немиелиированные аксоны более стройные (обычно диаметром 1 м) и, как правило, присутствуют в пучках (remak bundles), где они, как правило, слишком тесно используются для решения друг друга.
  2. Если она доступна на микроскопе, активируйте систему автоматического фокусировки, чтобы сохранить фокус в течение таймлапса.
  3. Приобретите яркое поле эталонное изображение. Запишите ориентацию нерва (позвоночника-проксимальных и дистальных концов) по отношению к изображениям.
  4. Приобретите конфокальное изображение с помощью лазера 488 нм и фильтра выбросов, подходящего для paGFP (например, 525/50 нм) для записи автофлюоценции добеления. Держите лазерную мощность низкой, чтобы свести к минимуму фотобледачи, с экспозицией время с поправкой соответствующим образом для обнаружения слабого сигнала. В качестве примера, репрезентативные данные были получены на 5% лазерной мощности и 4 с воздействия. Запишите настройки приобретения для использования во всех будущих экспериментах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После фотоактивации идеальные настройки изображения будут производить соотношение сигналов к шуму , 8 и фотосъемка менее 25% от исходного сигнала в течение 20 изображений. Аксоны также могут быть изображены широкоугольной микроскопией эпифлуоресценции, как мы делали первоначально7, но качество изображения будет хуже из-за отсутствия конфокальности.
  5. Установите мощность лазера примерно в 5x нормальной мощности изображения и получить изображение со временем экспозиции 3-4 минут. Хотя этот шаг не является существенным, этот шаг рекомендуется отбеливать аутофлюоресценции и других источников нежелательной флуоресценции для того, чтобы уменьшить фоновый сигнал и, таким образом, максимизировать сигнал к шуму фотоактивированной флуоресценции.
  6. Приобретите изображение с настройками, используемыми в шаге 5.4 для записи автофлуоресценции до активации после этого шага отбеливания.
  7. На изображении яркого поля нарисуйте линию, параллельную аксону с длиной, равной желаемому размеру окна активации. Длина этого окна будет варьироваться в зависимости от экспериментальной цели и параметров, но типичные длины 5 мкм для парадигмы пульс-побега и 40 мкм для парадигмы распространения пульса.
  8. Используя эту линию в качестве руководства, нарисуйте прямоугольную область интереса (ROI) через поле зрения перпендикулярно аксонов. Регион должен охватывать все аксоны для фотоактивации.
  9. Определите оптимальные настройки фотоактивации с 405 нм освещения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Только выполните этот шаг и подшагов до первой экспериментальной активации. В ходе эксперимента необходимо использовать те же настройки фотоактивации.
    1. Активировать область интереса неоднократно с помощью 405 нм лазерной линии, низкой лазерной мощности (например, 5%), и пиксельного времени пребывания (например, 40 х) и одного импульса, приобретая изображение активированного флуоресценции GFP после каждой активации. Повторяйте до тех пор, пока флуоресценция больше не увеличивается, а затем количественно флуоресценции в области, интерес для каждого изображения.
    2. Участок средняя флуоресценция интенсивности по сравнению с пульс числа. Выберите количество импульсов, после которых флуоресценция больше не увеличивается в качестве оптимального количества импульсов для активации.
  10. Активировать флуоресценцию paGFP области обращается в шаге 5.8 узорчатые возбуждения с 405 нм света. Убедитесь, что изображение приобретено непосредственно перед активацией и сразу после активации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Идеальная активация paGFP будет производить четко определенный регион флуоресценции с острыми границами, содержащимися в рентабельности инвестиций.
  11. Начните 1-минутный таймер по мере завершения активации. В конце 1 минуты, начать приобретение timelapse серии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: 1-минутная задержка необходима для того чтобы обеспечить увеличение в флуоресценции которая наблюдается следуя за фотоактивацией paGFP11. Для метода пульс-распространения для измерения исходных склонов в центральном и фланговом окнах достаточно 5-10 минут с интервалами 30 секунд. Для метода пульс-побега период приобретения 30-150 минут с интервалами 5 или 10 минут таймлапса позволяет анализировать долгосрочное поведение паузы нитей
  12. Сохранить все приобретенные изображения, а также рентабельность инвестиций, используемую для активации флуоресценции.
  13. Перемещение в новую область нерва и повторить шаги 5.1-5.11. Если новый регион находится вдоль того же аксона, он должен быть не менее 500 мкм от ранее активированной области, чтобы избежать обнаружения флуоресцентных нейрофиламентов, которые вышли из другой активированной области. Приобретение последнего таймлапса должно завершиться до конца 3-часового окна.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Возможно, что препарат может быть жизнеспособным в течение более 3 часов, но мы не подтвердили это. При умелом вскрытии и подготовке в течение этого 3-часового окна можно приобрести от пяти до восьми 10-минутных наборов изображений замедленного заключения.
  14. После того, как будет приобретена финальная серия изображений, остановите поток солевого раствора, отключите раствор и камерные обогреватели, удалите аппарат перфузии со сцены микроскопа.

6. Флэтфилд и темное поле изображение приобретения

  1. Сделать раствор флуоресцеина, добавив 250 мг порошка флуоресцеина на 0,5 мл двойной дистиллированной воды. Смешайте до тех пор, пока нет видимых частиц и спина раствор в течение 30 секунд в столешнице центрифуги для осадки любого нераспределеного материала. Это решение может храниться в течение нескольких месяцев при 4 градусах Цельсия, если защищено от воздействия света.
  2. Добавьте 8 мл раствора флуоресцеина в слайд и нанесите #1,5 крышки. Помарка лишнюю жидкость, печать с лаком для ногтей, и дать высохнуть.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При такой высокой концентрации, сильное поглощение флуоресцеина красителя гасит освещающий луч в растворе, производя тонкую плоскость флуоресценции на поверхности крышки, которая является одновременно равной и устойчивой к фотобьянию из-за быстрого диффузивного обмена12.
  3. Поместите флуоресцеин слайд coverslip-стороне вниз на перевернутой стадии микроскопа и настроить акцент на тонкой плоскости флуоресценции на поверхности крышки. Перемещение вокруг слайда, чтобы найти поле зрения, которое не содержит пузырьков воздуха (темные пятна) или крупных частиц флуоресценов (яркие пятна).
  4. Приобретите z-стек, охватывающий 6 мкм с интервалами 0,2 мкм, таким образом, что среднее изображение является исходной фокусировкой. Используйте короткое время экспозиции (например, 40 мс), потому что флуоресценция будет очень яркой. Это приобретение z-stack необходимо для захвата максимальной флуоресценции по всему полю зрения, так как крышки редко бывает идеально горизонтальным, а плоскость флуоресценции флуоресцентора флуоресцентории флуоресцентории флюоресцентора очень узкая. Повторите это в общей сложности 25 полей зрения, перемещая сцену по крайней мере на 20 мкм в любом направлении между полями.
  5. Закройте все ставни светового пути, включая затвор камеры, и установите мощность лазера и время экспозиции к нулю. Приобретите стопку из 100 изображений с этими настройками. Эти изображения будут усреднены для создания изображения darkfield, которое будет использоваться для коррекции темного тока и смещения смещения смещения на чипе камеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приобретение потоковой передачи является идеальным способом для захвата этих изображений.

7. Изображение гликолититически ингибируемые нервы для коррекции отбеливателя

  1. Сделать и оксигенировать солевой раствор, как в шаге 1; Однако заменить 2-дезоксия-D-глюкозы для D-глюкозы и добавить 0,5 мМ йодоацетат натрия для ингибирования гликолиза13. Мы называем это "ингибирующим физраствором".
  2. Повторите шаги 2-5 с помощью ингибирующего солевого раствора, с 10-30 минутом изображения timelapse набор в шаге 5.11. Разрешить 40-50 минут после применения ингибирующего солевого раствора перед визуализацией, чтобы обеспечить полное ингибирование нейрофиламента транспорта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Гликолитическое ингибирование в конечном итоге убить аксоны так что есть узкое окно времени после ингибирования, в котором для получения данных, как правило, около 30 минут. Индикатором уровня метаболического ингибирования является флавин аутофлюорессия аксональных митохондрий, которые могут быть обнаружены в серии таймлапсов из-за длительного воздействия, которое мы используем для изображения paGFP флуоресценции14. Как правило, митохондриальная аутофлюоресценция будет увеличиваться во время лечения ингибирующим физраствором. Если митохондрии начинают округляться или фрагментироваться, то прекратите визуализацию.

8. Обработка и анализ изображений с использованием ImageJ

  1. Флэтфилд и темное поле коррекции
    1. Откройте стек изображения darkfield и усредните изображения путем щелкать изображение Стеки Проект и выбор средней интенсивности в выпадаемом меню для создания изображения darkfield.
    2. Откройте флуоресцеин плоские стеки изображения и создать максимальную интенсивность проекции каждого (25 в общей сложности), нажав изображение Стеки Проект и выбор Max Intensity в выпадаемом меню.
    3. Объедините результируемые 25 максимальных проекционных изображений в один стек, нажав на изображение Стеки Изображения в стек. Создайте проекцию средней интенсивности этого стека, нажав на изображение Стеки Проект и выбор средней интенсивности из меню выпадения для создания изображения flatfield.
    4. Вычесть изображение темного поля из плоского поля изображения, нажав процесс Калькулятор изображений,выбрав Вычитание в качестве операции. Убедитесь, что 32-битный (поплавок) параметр результата проверяется. Результатом является исправленное изображение плоского поля.
    5. Измерьте среднюю интенсивность пикселей исправленного изображения плоского поля, предварительно нажав на Анализ Установите измерения и проверяя поле среднего серого значения, а затем нажимая клавишу 'm'.
    6. Разделите исправленное изображение плоского поля по его средней интенсивности, нажав на процесс Математика Разделите и введя среднее серое значение, полученное в шаге 7.1.5. Это даст обратный образ усиления.
    7. Откройте изображения предварительной активации и после активации вместе с стеком изображения timelapse. Объедините изображения в один стек, нажав на изображение Стеки Инструменты Concatenate, и выбрать изображения в хронологическом порядке из меню выпадения. Убедитесь, что опция Open as 4D-изображение не выбрана. Полученный стек представляет собой полный набор изображений.
    8. Повторите шаг 8.1.4 на полном наборе изображений,а затем разделите результат на обратное изображение усиления, нажав на процесс Калькулятор изображения и выбор раздела в качестве операции. Это позволит создать исправленный полный набор изображений,в котором каждое изображение было исправлено для несовечности в области освещения и на детекторе.
  2. Выравнивание стека изображений
    1. Чтобы исправить для несогласованности изображения самолетов в серии timelapse из-за стадии или образца дрейфа, установить Выравнивание фиксированной областью плагина (Дополнительный файл 1) нажав plugins Установите PlugIn, навигацию в папку, содержащую файл плагина, и выбрав плагин. Перезагрузка ImageJ после установки плагина.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот плагин выравнивает изображения на основе принципа "наименее квадратов congealing"15.
    2. Нарисуйте ROI на исправленном полном наборе изображений, который охватывает несколько аксонов и не выходит за пределы проксимальных и дистальных границ активированной флуоресценции в каждом из аксонов. Геометрия региона не имеет значения, однако за исключением областей, в которых структуры меняют форму или размер, улучшит выравнивание.
    3. Запустите плагин выравнивания, нажав plugins Выравнивание по фиксированной области. Плагин помещает по умолчанию 2-пиксельный максимум на смещение между кадрами, однако это может быть скорректировано в исходное всплывающее окно, если есть значительный дрейф образца. Выравнивание может занять несколько минут, в зависимости от размера стека изображений.
    4. Визуально осмотрите выровненный стек для оценки качества выравнивания. Некоторые кадры могут затем быть выровнены вручную, так как автоматизированное выравнивание может не функционировать хорошо для больших колебаний флуоресценции между кадрами. Это может быть достигнуто при просмотре кадра, который должен быть перенесен, нажав изображение Преобразование Перевод. Нажмите Нет на следующем всплывающем окно с просьбой о том, весь стек должен быть переведен. Используйте только целые значения пикселей в переводе и убедитесь, что меню интерполяции выпадения устанавливается на None,так как фракционные пиксельные сдвиги или интерполяция изменят данные из-за повторной загрузки интенсивности пикселей.
    5. Сохраните это как выровненный полный набор изображений.
  3. Измерение интенсивности флуоресценции
    1. Нарисуйте ROI с помощью инструмента Угол на первом кадре выровнен полный набор изображений с первой рукой вдоль одного края активированной области, перпендикулярно аксонов, а вторая рука вертикальной. Нажмите клавишу 'm' для измерения угла, который описывает ориентацию аксонов в поле зрения.
    2. Установите масштаб изображений так, чтобы размеры измерялись в микронах, нажав На кнопку «Анализ» Установите шкалу и введя соответствующие значения.
    3. Откройте менеджер ROI, нажав На анализ (ru) Инструменты Менеджер по рентабельности инвестиций. Для парадигмы пульс-побега, пропустите шаг 8.3.7. Для пульс-распространения, продолжать шаг 8.3.4.
    4. Нарисуйте квадратную рентабельность инвестиций любых измерений, а затем нажмите Редактировать Отбор Укажите. Убедитесь, что параметр Масштабированных единиц проверяется, а затем установите рентабельность инвестиций на ширину 15 мкм и высоту, равную или превышающую высоту изображения.
    5. Поверните рентабельность инвестиций под углом, измеренным в шаге 8.3.1, нажав на Edit Отбор Поверните, чтобы сделать его перпендикулярно аконам, и поместите roi с одной стороны вдоль проксимального края активированной области. Добавьте эту рентабельность инвестиций, которую мы будем называть проксимальной реготовить, к менеджеру, нажав на 't' ключ.
    6. Перетащите рентабельность инвестиций, чтобы выровнять с дистальной кромкой активированного региона и снова добавьте к менеджеру ROI, нажав клавишу 't'. Мы будем ссылаться на это как дистальный руководство рентабельности инвестиций. Проксимальные и дистальные НАправляющие БУДУТ использованы позже для рисования ОИ измерения фланговых измерений.
    7. Выберите аксоны для количественной оценки, используя последовательность изображений timelapse, полученную в шаге 5.11 выше. Эта последовательность изображений полезна для этой цели, поскольку она фиксирует слабую аутофлюоресценцию аксонов, раскрывая их морфологию за пределами активированной области.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аксоны, не отвечающие следующим критериям, исключены из анализа:
      1. Аксоны должны быть в фокусе по всей длине всех измерительных окон.
      2. Аксоны должны находиться в пределах 5 градусов перпендикулярно проксимальным и дистальным концам области активации.
      3. Аксоны не должны иметь инвагинации в пределах 5 мкм проксимальных и дистальных концов области активации.
      4. Исключить аксоны, которые заметно меняют форму в ходе визуализации.
      5. Исключите аксоны, которые кажутся нездоровыми, о чем свидетельствует отсутствие дискретной активированной области в изображении после активации(рисунок 2C, дно), так как это свидетельствует о диффузивной дисперсии активированной флуоресценции, которая происходит, когда аксон умирает.
    8. Наблюдайте длинно подверженное отбеливание изображения от шага 5.5 для автофлуоресцентных структур внутри аксонов. Эта флуоресценция из-за флавинов в митохондрии16. Исключите аксоны из анализа, если эти митохондрии кажутся округлыми или фрагментарными(рисунок 2D,дно), в отличие от расширенных, линейных структур(рисунок 2D, сверху), так как это является признаком метаболического снижения.
    9. Используя проксимальные и дистальные направляющие, созданные выше, нарисуйте три измерения ROIs на анализируемый аксон: центральное окно, охватывающее аксон в области активации 40 мкм, и два фланговых окна с шириной, ограниченной фланговым окном 15 мкм ROIs и высотой, ограниченной диаметром аксона на границе области активации. Добавьте все три региона к менеджеру ROI. Для гликолитически ингибируемых аксонов нарисуйте одну область шириной не более 5 мкм в середине активированной области и которая не простирается за пределы аксона. Для парадигмы пульс-побега активированная область шириной всего 5 мкм, поэтому необходимо использовать все окно.
    10. Повторите шаг 8.3.9 для всех аксонов, которые отвечают критериям шагов 8.3.7 и 8.3.8.
    11. Установите активные измерения для средней интенсивности пикселей, нажав На кнопку Анализ Установите измерения и выбирай параметр среднего серого значения. Убедитесь, что другие параметры измерения не проверяются.
    12. Выберите все ROI в окне менеджера рентабельности инвестиций, выбрав окно и нажав кнопку 'Ctrl' и 'a'. В окне менеджера рентабельности инвестиций щелкните Подробнее Мультимерия для измерения интенсивности флуоресценции. Копировать данные из окна результатов в электронную таблицу для дальнейшего анализа.
    13. Установите активные измерения в область региона, нажав На кнопку Анализ Установите измерения и выбирай вариант области. Убедитесь, что другие параметры измерения не проверяются.
    14. Повторите шаг 8.3.12. Необходимо скопировать только один ряд результатов для области, так как область не меняется со временем.

9. Фотоблеч коррекции

  1. В таблице данных для гликолитически ингибируемых аксонов вычитайте среднее флуоресценцию кадра 1 (преактивный кадр) от средней флуоресценции каждого кадра, начиная с кадра 3 (первый временной каркас) для данной рентабельности инвестиций. Результаты являются фоном вычитается средств.
  2. Участок данных, как рассеяние с кадром номера, как абсцисса. Приготовить экспоненциальную линию тренда к данным из каждой рентабельности инвестиций (большинство программ электронной таблицы имеют эту функцию) с уравнением в виде Ae-bx. Это уравнение эквивалентно функции фотосъемки Ft q F0 й-tɣ где F0 является флуоресценцией в первом кадре таймлапса, ɣ экспоненциальная скорость отбеливания, т это время, и e является естественной базой логарифма.
  3. Повторите шаги 9.1.1-9.1.2 для всех ROIs всех аксонов от гликолитно ингибируемых нервов. Для наиболее точной оценки скорости фотосъемки используйте не менее 15 аксонов в общей сложности, не менее 5 отдельных нервов. Используйте среднее значение экспоненциальных темпов отбеливания (ɣ) от всех ингибируемых аксонов для коррекции экспериментальных данных для фотоблечи. Новая калибровочная калибровка должна быть выполнена для каждого эксперимента или исследования, потому что фотоотделение зависит от параметров приобретения изображения и мощности лазера, который может меняться с течением времени.
  4. Повторите шаг 9.1.1 для всех областей аксонов, изображенных с нормальным солевым раствором (т.е. не гликолитически ингибируется).
  5. Разделите каждую точку данных наe-tɣ,используя время для t и среднее ɣ найдено в шаге 9.1.3. Это фотоблагосы исправлены средства.
  6. Умножьте каждую точку данных на область для этого интересующего региона, чтобы найти общую флуоресценцию в этом регионе в каждый раз.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 3 показаны репрезентативные изображения экспериментов по пульсу и импульсу распространению. Мы опубликовали несколько исследований, которые описывают данные, полученные с помощью метода пульс-побега и наши методы для анализа этих данных5,,6,7,8,17. Ниже мы покажем, как импульсно-распространенные данные могут давать информацию о направленности и скорости нейрофильтрационного транспорта, о которой мы ранее не сообщали.

Нейрофиламент транспорта в аксоне является прерывистым и двунаправленным. Этот транспорт можно описать по доле нитей, движущихся в любой момент времени в андероградском и ретроградных направлениях, Equation 41 Equation 40 и соответственно, и их скорости в анограда и ретроградных направлениях, обозначаемых Equation 39 и Equation 38 . Если взять общее количество нейрофиламента полимера на единицу длины аксона, чтобы Equation 37 быть, то потоки в антероград и ретроградных направлениях через данный регион даны

Equation 36

И

Equation 35,

соответственно, и общий поток Equation 34 дается

Equation 33,

где Equation 70 имеетединицы м -1, Equation 32 имеет Equation 31 единицы и Equation 34 Equation 30 единицы . Так как поток в данном месте вдоль аксона является количество нейрофильтра полимера, который движется мимо этого местоположения в единицу времени, это связано со средней скоростью Equation 29 через Equation 28 . Таким образом, мы можем написать

Equation 27.

В эксперименте, распространяющем пульс, поток может быть определен по скорости отклонения флуоресцентных нейрофилов из активированной области, которую мы называем центральным окном. Полная потеря флуоресцентного нейрофильтраментного полимера из этого центрального окна в секунду Equation 26 является суммой потерь из-за флуоресцентных нейрофильтраментных полимеров, оставляющих в антероградском и ретроградном направлениях, т.е.

Equation 25

Нормализуется к первоначальному содержанию флуоресцентного нейрофильтрамерного полимера в центральном окне, Equation 24 т.е. где Equation 23 находится длина центрального окна, эта скорость потери затем становится

Equation 22

где Equation 21 наклон снижения флуоресценции в центральном окне, которое изначально линейно на период времени, данное Equation 20 8. Для центрального окна на 40 мкм это приравнивается к десяткам секунд. Однако для окон такой большой переход к экспоненциальной фазе распада происходит постепенно, и наклон фактически линейный в течение нескольких минут или более8.

В ранние времена фланговые окна захватывают все нейрофиламенты, которые выходят из центрального окна, потому что эти нити не имеют достаточно времени, чтобы пройти через фланговые окна и выйти из них с другой стороны. В этом случае количество флуоресцентного нейрофильтраментного полимера, который оставляет центральное окно anterogradely и ретроградно в секунду, т.е. потоки Equation 19 и Equation 18 , даются увеличение содержания нейрофиламента Equation 17 и в Equation 16 фланговых окнах. Нормализовано с первоначальным содержанием флуоресцентного нейрофильтра полимера в центральном окне, темпы увеличения фланговых окон становятся

Equation 15

Equation 14

где Equation 13 и Equation 12 есть склоны увеличения флуоресценции в проксимальных и дистальных фланговых окнах, соответственно.

Таким образом, мы можем выразить среднюю скорость с точки зрения склонов в фланговых окнах, т.е.

Equation 11      (Eq. 1)

и соотношение числа антероград и ретроградных движущихся нейрофиламентов с точки зрения соотношения этих склонов, т.е.

Equation 10     (Eq. 2)

где Equation 9 и Equation 8 обозначают ставки, с которыми нейрофиламенты обратном от anterogradely к ретроградно движущихся и наоборот8. Значения Equation 7 и Equation 6 могут быть определены путем измерения движения отдельных нейрофиламентов в культивируемых нейронов, как сообщалось ранее17. Важно отметить, что выражение скорости в Eq. 1 применяется только в короткие сроки после активации, во время которой флуоресцентные нейрофиламенты попадают в фланговое окно, но не выходят. Продолжительность этого короткого временного окна будет зависеть от длины фланговых окон и кинетики движения нейрофиламента. Чем длиннее фланговые окна, в принципе, тем длиннее временное окно. Теоретически можно проверить, что этот критерий соблюдается, подтверждая, что

Equation 5     (Eq. 3)

В отличие от выражения скорости в Eq. 1, которое дается разница между склонами в фланговых окнах, выражение направленности в Eq. 2 является надежным к размеру флангового окна, потому что оно дается соотношением склонов в фланговых окнах.

Рисунок 3 показывает репрезентативные результаты пульс-побега и пульс-распространения экспериментов на миелинированных аксонов в тибиальный нерв 8-недельного мужского мышки из нашей hThy1 paGFP-NFM линии на C57Bl/6J фоне, используя окна размеров 5 и 40 мкм, соответственно. Мыши, по крайней мере 2 недели возраста, как мужчины, так и женщины, были использованы для этих экспериментальных парадигм. Соответствующий возраст и пол должны определяться исследователем в зависимости от того, что тестируется в исследовании. Со временем видно, что края активированных регионов размываются из-за отхода нейрофиламентов как в андерограде, так и в ретроградном направлениях, что приводит к потере флуоресценции из центрального окна.

Для метода пульс-побега(Рисунок 3A, C, E),кинетика флуоресценции распада в активированной области может дать информацию о долгосрочном и краткосрочном поведении паузы8,18. Для этих экспериментов активированная область может быть короткой (обычно мы используем 5 мкм; см. желтую коробку на рисунке 3A). Для метода пульс-распространения(Рисунок 3B, D, F), мы используем более активируемую область (40 мкм здесь; см. желтую коробку на рисунке 3B) для того, чтобы обеспечить больший пул флуоресцентных нейрофиламентов. Это удлиняет время, в течение которого увеличение флуоресценции в фланговых областях остается линейным (см. выше). Линейная область этого увеличения флуоресценции в фланговых окнах также может быть увеличена за счет увеличения длины этих окон, однако это ограничено размером поля зрения. Мы использовали 15 мкм фланговые окна, показанные красным и зеленым цветом, для данных, показанных на рисунке 3D.

На рисунке 3E,3F показана количественная оценка общей интенсивности флуоресценции (т.е. сумма интенсивности пикселей) для измерительных окон, показанных на рисунке 3C,3D соответственно. Для метода пульс-побега распад является двухфазным, с первоначальным экспоненциальным распадом, который представляет собой отход на дорожке нейрофиламентов. Этот переход примерно на 10-20 минут до второго медленнее экспоненциального распада, который представляет собой мобилизацию и отъезд вне дорожки нити8. Для сравнения с методом пульс-распространения, мы показываем только 12-минутный курс времени на рисунке 3E, но обычно время хода анализа должно быть длиннее (обычно 30-120 минут), чтобы захватить долгосрочную паузу кинетики5,6,18. Для стратегии распространения пульса расчеты скорости и направленности движения зависят только от наклонов в фланговых окнах. Для длины окна, используемой здесь, линейная фаза длится около 5 минут. Продолжительность этого временного окна линейности должна оцениваться путем постепенного сокращения времени, используемого для измерения наклона, и определения точки, в которой наклон больше не увеличивается. Эта продолжительность может быть увеличена за счет увеличения длины окна, если поле обзора камеры позволяет, хотя длина окна должна быть постоянной для всех аксонов в данном эксперименте. В качестве примера мы использовали первые 5 минут данных для измерения склонов для данных импульсного распространения на рисунке 3F. Это приводит к склонам 72 A.U./min, -594 A.U./min и 111 A.U./min для проксимальных, центральных и дистальных окон, соответственно (A.U. - произвольные единицы). Для того, чтобы нормализовать эти значения, они делятся на начальную флуоресценцию центрального окна, в результате чего ставки 0,108 %F0/мин, -0,962 %F0/min и 0,173 %F0/min. Применение экв. 3 мы находим, что критерий сохранения не выполнен, указывая, что мы не захватываем все флуоресценции в фланговых окнах. Это техническое ограничение из-за поля зрения нашей камеры EMCCD (82 мкм х 82 мкм). Камеры с чипами sCMOS, которые могут иметь гораздо большие поля зрения, могут позволить использовать большие размеры фланговых окон. Однако мы не можем исключить возможность того, что это несоответствие между центральным и фланговым склонами может быть также обусловлено, по крайней мере частично, недооценкой масштабов фотосъемки (см. Обсуждение), что приведет к недооценке положительных склонов в фланговых окнах и завышению отрицательного склона в центральном окне.

Из ставок в фланговых окнах (%F0/min)и Eq. 2 выше, а с использованием значений Equation 4 и Equation 3 17мы вычисляем соотношение Equation 2 2,12. Это указывает на то, что 68% нитей двигались позабавке, а 32% ретроградными. Используя те же тарифы и Eq. 1 выше, мы вычисляем среднюю чистую скорость населения Equation 1 40 "(0,00173-0,00108) - 0,026 мк/мин, или 0,037 мм/день. Радиоизотопные исследования пульса на мышах аналогичного возраста сообщили о скорости нейрофильтрации населения примерно 0,6 мм/день в наиболее проксимальных участках седалищного нерва, замедляясь до 0,12 мм/день на расстоянии двух сантиметров19,,20. Наши данные пульс-распространения были собраны в тибиальном нерве, примерно еще 2-3 сантиметра дистального к этим мерам. По причинам, упомянутым выше, мы считаем, что оценка 0,037 мм в день является недооценкой истинной скорости. Однако, экстраполируя пространственное замедление наблюдается радиоизотопной маркировки пульса в тибиальный нерв эта оценка не является необоснованным, особенно если учесть, что она была определена с использованием совершенно другой методологии на очень разных пространственных и временных масштабах.

Чтобы продемонстрировать способность метода пульс-распространения для обнаружения значительных различий между популяциями, мы сравнили проксимальные и дистальные фланговые оконные склоны, измеренные из нервов, пронизанных как нормальными, так и ингибиторными солями. Ингибирование гликолиза блокирует движение нейрофиламентов, как мы уже сообщали ранее5,,6,,7. Мы обсудим позже выбор образцов размеров для экспериментов, однако здесь мы использовали один нерв в нормальном солевом растворении и два в ингибирующем солевом растворении, из-за ограничения одного поля приобретения на нерв во время ингибирования. Рисунок 4A показывает пример таймлапса из гликольтически ингибируемого нерва, демонстрируя явное сокращение переноса из активированной области. Действительно, мы находим значительно ниже дистальных и проксимальных склонов(Рисунок 4B, р 0,00000639 и 0,0121, соответственно, пару Tukey сравнения после ANOVA) в нервах, обработанных ингибирующим физионовым по сравнению с теми, пронизаны нормальным физиологическим раствором. Мы также находим значительное снижение скорости населения между этими двумя условиями(Рисунок 4C, р 0,0232, т-тест с неравными отклонениями, после теста F для равного отклонения с р 0,0190).

Figure 1
Рисунок 1: камера перфузии. ( A )Диаграмма,показывающая сборку корпуса камеры перфузии и внешней прокладки, с трубками, соединенными с солевым шприцем и колбой для отходов. (B) Диаграмма, показывающая сборку самой камеры. Внутренняя прокладка укладывается плашмя на верхней части #1,5 крышки. Нерв помещается на крышку в хорошо созданном прямоугольным отверстием внутренней прокладки. Слайд микроакедука помещается над нервом, чтобы зажать нерв между #1,5 крышки и слайд микроакудук. Наконец, сэндвич переворачивается перед монтажом поверх внешней прокладки сборки, показанной в(A)и закреплена замковым кольцом (не показано). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: подготовка к тибиалу нерву. (A) Изображение, показывающее расположение голени нерва в ноге мыши, в котором ягодицы superficialis, бицепс фемори, semitendinosus, popliteus, tibialis caudalis и сгибатель digitorum longus мышцы были удалены. Тибиальный нерв можно рассматривать как одну из трех основных ветвей седалищного нерва, возникающих на колене. (B) Схема нерва в поперечном сечении в собранной камере, показывая масляное погружение цели под крышкой. Лучшее оптическое качество получено путем активации и визуализации слоя аксонов, выложенных на поверхность крышки; качество изображения снижается глубже в нерв из-за рассеяния света. (C) Примеры здорового аксона (вверху) и нездорового аксона (внизу) сразу после активации. Пунктирной желтой линии обозначает активированную область. Активированная флуоресценция имеет острые границы в здоровом аксоне, в то время как в нездоровом аксоне активированная флуоресценция быстро рассеивается из активированной области, заполняя аксон в течение нескольких секунд. Масштабная штанга 10 мкм. (D) Примеры митохондриального появления в здоровом аксоне (вверху) и нездоровом аксоне (внизу). Митохондрии видны из-за флавин автофлуоресценции16. Они появляются линейные (твердые наконечники стрел) в здоровых аксонов. В нездоровых аксонов, митохондрии сначала становятся пунктуатыми (открытые наконечники стрел), а затем слабее с течением времени, обеспечивая показатель здоровья аксона. Распахнутый открытый наконечник стрелы в здоровом аксоне указывает на митохондрион, переходя от линейного к пунктуару. Масштабная штанга 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Пульс-побег и импульс-распространенные эксперименты. Пример предварительной активации, после активации и таймлапс изображения миелинированных аксонов в тибиальный нерв 8-недельной мыши в ()импульс-побег эксперимента и (B) импульс распространения эксперимента. Изображение перед активацией — это верхняя панель с изображениями после активации ниже.  Отметки времени показывают время, прошедшее после активации. В желтом цвете области активирована область. Эти активации были выполнены с помощью 5 сканирований с 40 пиксельного времени пребывания и 5% лазерной мощности. Масштабные батончики ю 10 мкм. (C) Измерение ROIs (желтый) для трех аксонов в эксперименте пульс-побег. (D) Проксимальный (красный), центральный (желтый) и дистальный (зеленый) измерения ROIs для трех аксонов в импульс-распространенный эксперимент. Измерения ROIs для каждого аксона показаны в твердом красном (проксимальном), твердом желтом (центральное окно) и твердом зеленом (дистальном окне). (E) Участок средней флуоресценции по сравнению со временем, в среднем 3 аксонов в C. Dashed линия экспоненциальной функции подходят к данным, из формы Ft -E-T, как описано ранее7. F) Участки флуоресценции в центральной, дистальной и проксимальной ROIs по сравнению со временем, в среднем 14 аксонов, включая три аксонов в D. Склон рассчитывается от трендовых линий, пригодных для первых 5 минут данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: Влияние метаболических ингибиторов на нейрофиламент транспорта. () Примерtimelapse изображения нерва pretreated с 5.6% (w/v) 2-дезоксия-глюкоза и 0.5 mM iodoacetate натрия для того чтобы ингибировать гликолиз и истощать клетчатый ATP. Обратите внимание, что дистозные и проксимальные границы активированных регионов остаются острыми, что свидетельствует об ингибировании нейрофильтрации транспорта. Масштабная планка No 10 м. (B) Количественная оценка склонов в дистальных (D) и проксимальных (P) фланговых окнах (антироград и ретроград, соответственно), выраженной в процентах от начальной флуоресценции в центральном окне (%F0/min),от одного нерва (14 аксонов) с использованием стандартного солевого раствора и от двух нервов (8 аксонов) предустановаемого с помощью ингибитора с гликолько. (C) Нейрофильтра скорости населения рассчитывается со склонов в фланговых окон, показывая значительное снижение скорости после ингибитора лечения. - р-л; 0,005; - р-л; 0,01; - р-л; 0,05. Данные свидетельствуют о значительном нарушении переноса нейрофиламента в присутствии ингибиторов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительное видео. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать это видео.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Необходимо проявлять осторожность при анализе экспериментов по пульсу и пульс-распространению, поскольку существует значительный потенциал для введения ошибки во время постобработки, главным образом во время коррекции плоского поля, выравнивания изображения и коррекции отбеливателя. Коррекция плоского поля необходима для коррекции несовечности в освещении, что приводит к падению интенсивности по всему полю зрения от центра к периферии. Степень неравномерности зависит от длины волны и, таким образом, всегда должна выполняться на длине волны, которая должна использоваться для получения экспериментальных данных. Важно обеспечить, чтобы неравномерность изображения плоского поля действительно репрезентативна для неравномерности изображений, которые должны быть исправлены. Эксперименты, распространяющие импульсы, особенно уязвимы к ошибкам, присужаемой коррекции плоского поля, поскольку РОЛИ измерения распространяются на периферию изображения, где интенсивность выпадения является наибольшей.

Оптимальные настройки активации paGFP будут варьироваться в зависимости от метода активации и параметров лазера и должны быть определены эмпирически до первой сессии визуализации. Слишком мало активации приведет к низкому соотношению сигнала к шуму для активированной флуоресценции, в то время как слишком много приведет к отбеливанию активированной флуоресценции, потому что как неактивированные и активированные paGFP могут быть возбуждены фиолетовым светом. Для выборочного освещения региона интереса к изображению мы используем лазерный галво сканер Andor FRAPPA, который генерирует четко определенную область флуоресценции с острыми границами, как показано в результатах представительства. Мы также имели успех с помощью Андор Мозаика Цифровой диафрагмы, которая представляет собой цифровое устройство микромерора, с ртутью дуговой лампы в качестве источника освещения7. Другие варианты доступны на коммерческой основе. Проблема при работе с paGFP является задержка увеличения интенсивности флуоресценции, что происходит в течение 1 минуты после шага фотоактивации. Это увеличение происходит потому, что освещение с фиолетовым светом вызывает часть активированных молекул paGFP, чтобы войти в "темное состояние", из которого они могут расслабиться обратно на время курса десятков секунд11. По нашему опыту, увеличение, как правило, менее 5% с широкими возбуждения поля, но может превышать 20% с лазерным возбуждением, что может привести к значительной недооценке активированной флуоресценции. Мы учитываем это, приобретая второе изображение «пост-активации» флуоресценции paGFP через 1 минуту после фотоактивации, а затем используем это изображение в качестве ориентира для последующего таймлапса. Тем не менее, важно признать, что это вводит еще один потенциальный источник ошибки в определении первоначальной флуоресценции и распада кинетики в раннее время.

Дополнительное внимание следует уделить выравниванию стеков изображений. Основным источником несогласованности является дрейф или другое движение образца во время приобретения изображения таймлапса. Это можно свести к минимуму с помощью внутренних прокладок соответствующей толщины и позволяет препарату "поселиться" перед визуализацией. Однако любая такая задержка приведет к сокращению времени, необходимого для приобретения изображений, поскольку подготовка имеет ограниченное окно жизнеспособности. Также важно избегать алгоритмов выравнивания изображения или введения субпиксельных сдвигов, так как эти процедуры будут resample интенсивности пикселей на изображении. Эксперименты, распространяющиеся импульсы, особенно уязвимы к ошибкам, возникающим в результате неправильного выравнивания, поскольку границы региона активированной флуоресценции являются относительно острыми, а флуоресценция в этом регионе значительно выше, чем фланговые неактивированные регионы. Даже небольшое несогласованность плоскостей изображения в стеке может привести к большим скачкам значений флуоресценции в дистальных и проксимальных окнах измерения. Таким образом, крайне важно, чтобы наборы изображений были выровнены должным образом и тщательно проверены, прежде чем приступить к анализу.

Коррекция для фотобледачи необходима для обеспечения того, чтобы изменения интенсивности флуоресценции с течением времени точно отражали изменения в количестве флуоресцентного белка. Такие исправления могут быть значительным источником ошибок при оценке абсолютной интенсивности флуоресценции в центральном и фланговом окнах. Поскольку фотосъемка кинетика зависит от интенсивности освещения и окружающей среды фторфора, фактические показатели фотосъемки могут варьироваться в зависимости от сеансов и от аксона до аксона. Таким образом, необходимо измерить несколько аксонов и среднее количество полученных данных, что само по себе вводит некоторую ошибку. Описанный выше подход заключается в лечении нерва с гликолитическими ингибиторами, а затем активировать флуоресценцию в области интереса и отслеживать потерю интенсивности флуоресценции с течением времени. Ингибиторы гликолитических истощают АТФ и тем самым препятствуют переносу нейрофиламента, так что потеря флуоресценции полностью связана с фотобрелированием, а не перемещением нейрофиламентов из активированной области. Средняя кинетика отбеливания, определяемая таким образом, затем используется для коррекции экспериментальных данных. Поскольку нецелесообразно выполнять отдельную калибровку отбеливания в каждом сеансе визуализации, одна калибровка должна применяться к нескольким сеансам, распределенным в течение многих недель. Недостатком такого подхода является то, что он не учитывает изменения в интенсивности лазерной мощности/освещения изо дня в день, что, следовательно, должно контролироваться. Альтернативный подход, который мы называем "внутренней коррекции отбеливания", заключается в оценке фотоблеси путем количественной флуоресценции в центре активированной области в то же времяlapse фильмы, которые используются для транспортных измерений. Если эта область измерения расположена в центре и намного короче, чем длина активированной области, а затем в короткие сроки любые флуоресцентные нейрофиламенты, которые выходят из области измерения, будут заменены флуоресцентными нейрофиламентами, которые перемещаются в него. Однако со временем вероятность перехода ненесутных нейрофиламентов в область измерения от фланговых ненесутных областей аксона возрастает, что приводит к завышению потери флуоресценции из-за отбеливания. Преимущество этого подхода заключается в том, что он корректирует характеристики отбеливания в пределах этого же поля, однако недостатком является то, что продолжительность временного окна должна определяться эмпирически и будет зависеть от скорости транспортировки, а также от длины активированного региона. Все это было сказано, следует отметить, что оценка направленности нейрофиламента транспорта с помощью нашего метода является надежным для отбеливания ошибок (как это для фланговых размер окна), потому что это дается соотношение склонов в фланговых окнах и любой коррекции отбеливания является множитель применяется как к числителю и знаменатель в этом расчете.

Из-за шума, присущего флуоресцентной системе, и возможности дополнительной ошибки, добавленной во время описанных выше шагов после обработки изображения, важно использовать большие размеры выборки для достаточной статистической мощности. Хотя невозможно точно определить демографические средства, отклонения и размеры эффекта перед экспериментами, мы рекомендуем использовать методКоэна 21, предполагая средний размер эффекта и альфа 0,05. Это приводит к dКоэна , который является разница в средствах, разделенных на объединенные стандартные отклонения обеих популяций, 0,5, что предполагает приобретение по крайней мере 105 образцов на группу. Как только этот порог будет достигнут, можно провести пост-специальный анализ власти для переоценки статистической мощи с учетом фактических демографических показателей. При оптимальных экспериментальных условиях, можно получить от 1-7 анализируемых аксонов (из 9-20 общих аксонов) за активацию, и 5-8 активаций на нерв при условии приобретения 10-минутного таймлапса за активацию.

Трансгенные мыши, выражаюющие флуоресцентные белкисинтеза,ориентированные на митохондрии или пузырьки, также были использованы для изучения аксонального переноса мембранных органелл в периферических нервах ex vivo22,23,24,25. Кроме того, лаборатория Schiavo разработала подходы к изображению аксонального транспорта ретроградно движущихся membranous органеллы в аксоны in vivo с использованием флуоресцентно помеченных фрагментов токсина столбняка, которые могут быть введены в мышцу и принимаются моторными нервными терминалами26. Однако, поскольку мембранные органеллы могут быть решены в этих аксонов с помощью флуоресценции микроскопии, можно проанализировать скорость и частоту их движения непосредственно с помощью таймлапса или кымограф анализа. Описанные здесь методы пульса и пульс-распространения были разработаны с конкретной целью анализа кинетики нейрофильтра в этих аксонах, в которых не могут быть решены отдельные нейрофиламенты. Для этого требуется анализ на уровне населения в течение нескольких минут или десятков минут. Мы используем трансгенную мышь для этой цели, но это также должно быть возможно, чтобы выразить фотоактивируемый белок с помощью таких методов, как вирусная трансдукции или в утробе электропорации. В то время как в центре внимания был нейрофиламент транспорта, пульс-побег и пульс-распространенные методы могут быть также адаптированы для изучения движения других цитоскелетных и цитозолических белков, которые перевозятся вдоль аксонов в медленных компонентов аксонального транспорта. Мы ограничиваем наши анализы миелинированными аксонами, потому что их размер и оболочка миелина позволяют нам решать их у соседей. Немиелиированные аксоны не могут быть решены из-за их небольшого калибра и склонности к скоплению в пучках Remak. Мы описываем использование tibial нервы ex vivo, но методы должны быть применимы к другим периферическим нервам, которые достаточно длинные (йgt;5 мм) и необуздаемые. В принципе, следует также можно адаптировать эти методы к изображению нейрофильтрации транспорта in vivo (например, хирургическим путем подвергая нерв в седативных мыши, а затем размещение мыши на стадии микроскопа).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Паулу Монсма за обучение и помощь в проведении конфокальной микроскопии и рассечения tibial нерва, а также доктора Ацуко Учиды, Хлои Дюгер и Сану Чаханде за помощь в работе с мышью. Эта работа была частично поддержана совместным Национальным научным фондом грантов IOS1656784 А.Б. и IOS1656765 p.J., и Национальные институты здравоохранения Гранты R01 NS038526, P30 NS104177 и S10 OD010383 до A.B. N.P.B. была поддержана стипендией от Университета штата Огайо президента постдокторской программы ученых.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
14 x 22 Rectangle Gasket 0.1mm Bioptechs 1907-1422-100 inner gasket
2-deoxy-D-glucose Sigma D6134
30mm Round Gasket w/ Holes Bioptechs 1907-08-750 outer gasket
35 x 10mm dish Thermo Fisher 153066 dissection dishes
40mm round coverslips Bioptechs 40-1313-0319
60mL syringe - Luer-lock tip BD 309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system Andor outfitted with Perfect Focus and FRAPPA systems
Calcium chloride Fisher C79
Coverslips Fisher 12-541-B for fluorescein slide
D-(+)-glucose solution Sigma G8769
Dissecting pins Fine Science Tools 26001-70
Dissection forceps Fine Science Tools 11251-30 fine tipped forceps
Dissection microscope Zeiss 47 50 03
Dissection pan with wax Ginsberg Scientific 568859
Dissection scissors Fine Science Tools 14061-09 initial dissection scissors
FCS2 perfusion chamber Bioptechs 060319-2-03
Fluorescein sodium Fluka 46960
Inline solution heater Warner Instruments SH27-B
Laminectomy forceps Fine Science Tools 11223-20 initial dissection forceps
Magnesium sulfate Sigma-Aldrich M7506
Microaqueduct slide Bioptechs 130119-5
Microscope slides Fisher 12-544-3 for fluorescein slide
Microscope stage insert Applied Scientific Instrumentation I-3017
Objective heater system Okolab Oko Touch with objective collar
Objective oil - type A Nikon discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective Nikon MRD01901
Potassium chloride Fisher P217
Potassium phosphate Sigma-Aldrich P0662
Sodium bicarbonate Sigma-Aldrich S6297
Sodium chloride Sigma-Aldrich S7653
Sodium iodoacetate Sigma-Aldrich I2512
Syringe pump Sage Instruments Model 355
Tubing adapter - female Small Parts Inc. 1005109
Tubing adapter - male Small Parts Inc. 1005012
Tygon tubing Bioptechs 1/16" ID, 1/32" wall thickness
Vannas spring scissors Fine Science Tools 15018-10 fine scissors

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffman, P. N., Lasek, R. J. The slow component of axonal transport. Identification of major structural polypeptides of the axon and their generality among mammalian neurons. Journal of Cell Biology. 66 (2), 351-366 (1975).
  2. Brown, A. Slow Axonal Transport. Reference Module in Biomedical Sciences. , (2014).
  3. Wang, L., Ho, C. -L., Sun, D., Liem, R. K. H., Brown, A. Rapid movement of axonal neurofilaments interrupted by prolonged pauses. Nature Cell Biology. 2 (3), 137-141 (2000).
  4. Uchida, A., Monsma, P. C., Fenn, J. D., Brown, A. Live-cell imaging of neurofilament transport in cultured neurons. Methods in Cell Biology. 131, 21-90 (2016).
  5. Trivedi, N., Jung, P., Brown, A. Neurofilaments switch between distinct mobile and stationary states during their transport along axons. Journal of Neuroscience. 27 (3), 507-516 (2007).
  6. Monsma, P. C., Li, Y., Fenn, J. D., Jung, P., Brown, A. Local regulation of neurofilament transport by myelinating cells. Journal of Neuroscience. 34 (8), 2979-2988 (2014).
  7. Walker, C. L., et al. Local Acceleration of Neurofilament Transport at Nodes of Ranvier. Journal of Neuroscience. 39 (4), 663-677 (2019).
  8. Li, Y., Brown, A., Jung, P. Deciphering the axonal transport kinetics of neurofilaments using the fluorescence photoactivation pulse-escape method. Physical Biology. 11 (2), 026001 (2014).
  9. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).
  10. Breuer, A. C., et al. Fast axonal transport in amyotrophic lateral sclerosis: an intra-axonal organelle traffic analysis. Neurology. 37 (5), 738-748 (1987).
  11. Bancaud, A., Huet, S., Rabut, G., Ellenberg, J. Fluorescence perturbation techniques to study mobility and molecular dynamics of proteins in live cells: FRAP, photoactivation, photoconversion, and FLIP. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (12), (2010).
  12. Model, M. Intensity calibration and flat-field correction for fluorescence microscopes. Current Protocols in Cytometry. 68, (2014).
  13. Schmidt, M. M., Dringen, R. Differential effects of iodoacetamide and iodoacetate on glycolysis and glutathione metabolism of cultured astrocytes. Frontiers in Neuroenergetics. 1, 1-10 (2009).
  14. Surre, J., et al. Strong increase in the autofluorescence of cells signals struggle for survival. Scientific Reports. 8 (1), 12088 (2018).
  15. Cox, M., Lucey, S., Sridharan, S., Cohn, J. Least Squares Congealing for Unsupervised Alignment of Images. Proceedings of the IEEE Computer Society Conference on Computer Vision and Pattern Recognition. , (2008).
  16. Huang, S., Heikal, A. A., Webb, W. W. Two-photon fluorescence spectroscopy and microscopy of NAD(P)H and flavoprotein. Biophysical Journal. 82 (5), 2811-2825 (2002).
  17. Fenn, J. D., Johnson, C. M., Peng, J., Jung, P., Brown, A. Kymograph analysis with high temporal resolution reveals new features of neurofilament transport kinetics. Cytoskeleton. 75 (1), 22-41 (2018).
  18. Alami, N. H., Jung, P., Brown, A. Myosin Va increases the efficiency of neurofilament transport by decreasing the duration of long-term pauses. Journal of Neuroscience. 29 (20), 6625-6634 (2009).
  19. Xu, Z., Tung, V. W. Temporal and Spatial Variations in Slow Axonal Transport Velocity Along Peripheral Motoneuron Axons. Neuroscience. 102 (1), 193-200 (2001).
  20. Jung, P., Brown, A. Modeling the Slowing of Neurofilament Transport Along the Mouse Sciatic Nerve. Physical Biology. 6 (4), 046002 (2009).
  21. Cohen, J. The effect size index: d. Statistical Power Analysis for the Behavioral Sciences 2nd ed. , Lawrence Erlbaum Associates. 20-26 (1988).
  22. Misgeld, T., Kerschensteiner, M., Bareyre, F. M., Burgess, R. W., Lichtman, J. W. Imaging axonal transport of mitochondria in vivo. Nature Methods. 4 (7), 559-561 (2007).
  23. Gilley, J., et al. Age-dependent axonal transport and locomotor changes and tau hypophosphorylation in a "P301L" tau knockin mouse. Neurobiology of Aging. 33 (3), 1-15 (2012).
  24. Marinkovic, P., et al. Axonal transport deficits and degeneration can evolve independently in mouse models of amyotrophic lateral sclerosis. Proceedings of the National Academy of Science of the United States of America. 109 (11), 4296-4301 (2012).
  25. Milde, S., Adalbert, R., Elaman, M. H., Coleman, M. P. Axonal transport declines with age in two distinct phases separated by a period of relative stability. Neurobiology of Aging. 36 (2), 971-981 (2015).
  26. Gibbs, K. L., Kalmar, B., Sleigh, J. N., Greensmith, L., Schiavo, G. In vivo imaging of axonal transport in murine motor and sensory neurons. Journal of Neuroscience Methods. 257, 26-33 (2016).

Tags

Нейронаука выпуск 162 аксональный транспорт нейрофиламент фотоактивация пульс-распространение пульс-побег нерв конфокальная микроскопия
Изображение и анализ нейрофиламента транспорта в акцизных мышь Tibial нерва
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Boyer, N. P., Azcorra, M., Jung, P., … More

Boyer, N. P., Azcorra, M., Jung, P., Brown, A. Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve. J. Vis. Exp. (162), e61264, doi:10.3791/61264 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter