वर्तमान प्रोटोकॉल हिप्पोकैम्पस के लिए वेंट्रल टेगमेंटल क्षेत्र (वीटीए) ग्लूटामेट अनुमानों का पता लगाने के लिए एक सरल विधि को दर्शाता है। वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स की फोटोटिमुलेशन को सीए1 रिकॉर्डिंग के साथ जोड़ा गया था ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि वीटीए ग्लूटामेट टर्मिनल वीवो में CA1 ख्यात पिरामिड फायरिंग दर को कैसे मिलाते हैं।
मस्तिष्क में न्यूरॉन उप-आबादी के ऑप्टोजेनेटिक मॉड्यूलेशन ने शोधकर्ताओं को वीवो और पूर्व वीवो में तंत्रिका सर्किट को विच्छेदन करने की अनुमति दी है । यह एक तंत्रिका सर्किट के भीतर न्यूरॉन प्रकार की भूमिका का निर्धारण करने के लिए एक आधार प्रदान करता है, और सीखने के सापेक्ष जानकारी एन्कोडिंग में उनका महत्व है। इसी तरह, इस विधि का उपयोग जागने और एनेस्थेटाइज्ड जानवरों में दो या अधिक जुड़े मस्तिष्क क्षेत्रों के शारीरिक महत्व का परीक्षण करने के लिए किया जा सकता है। वर्तमान अध्ययन दर्शाता है कि कैसे वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स एनेस्थेटाइज्ड चूहों के CA1 (हिप्पोकैम्पस) में ख्यात पिरामिड न्यूरॉन्स की गोलीबारी दर को संशोधित करता है। यह प्रोटोकॉल हिप्पोकैम्पस की परतों में वीटीए प्रेसिनैप्टिक ग्लूटामेट टर्मिनलों की ट्रेसिंग के लिए वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स की एडेनो-संबद्ध वायरस (एएवी) को रोजगार देता है। एएवी वेक्टर द्वारा बंदरगाह वाले प्रकाश-नियंत्रित ऑप्सिन (चैनलरोडोप्सिन; एचएचआर 2) और फ्लोरेसेंस प्रोटीन (ई वाईएफपी) की अभिव्यक्ति ने वीटीए ग्लूटामेट टर्मिनलों के एंटेरोग्रेड ट्रेसिंग की अनुमति दी, और वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन सेल निकायों (वीटीए में) की फोटोटिमुलेशन की अनुमति दी। वीवो में वीटीए फोटोसिमुलेशन के लिए मल्टी-यूनिट और सिंगल-यूनिट प्रतिक्रियाओं का पता लगाने के लिए उच्च बाधा तीव्र सिलिकॉन इलेक्ट्रोड सीए1 में तैनात किए गए थे । इस अध्ययन के परिणाम हिप्पोकैम्पस (CA1, CA3, और डीजी) में प्रेसिनैप्टिक वीटीए ग्लूटामेट टर्मिनलों के परत-निर्भर वितरण को प्रदर्शित करते हैं। साथ ही वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स की फोटोस्मिमुलेशन ने वीवो में ख्यात CA1 पिरामिड इकाइयों की फायरिंग और फट दर को बढ़ाया।
पिछले एक दशक में, न्यूरॉन-प्रकार मॉड्यूलेशन की विशिष्टता को बढ़ाने के लिए आनुवंशिक उपकरणों की एक सरणी विकसित की गई थी, और जटिल तंत्रिका नेटवर्क1की मैपिंग। विशेष रूप से, न्यूरोट्रोपिक वायरस को संक्रमित करने और न्यूरोनल कोशिकाओं में दोहराने की अंतर्निहित क्षमता वाले न्यूरोट्रॉपिक वायरस को न्यूरॉन उप-प्रकारों में विशिष्ट प्रोटीन को व्यक्त करने या फिर से शुरू करने के लिए तैनात किया गया है। फ्लोरेसेंस प्रोटीन या आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सिनैप्टिक गतिविधि संकेतकों को शरण देते समय, संक्रमित एएवी वैक्टर लेबल और मस्तिष्क क्षेत्रों में तंत्रिका नेटवर्क को चित्रित करते हैं2,3। एएवी निर्माण में प्रमोटर का चुनाव कुछ स्तर की विशिष्टता(प्रमोटर-निर्भर अभिव्यक्ति) के साथ न्यूरॉन प्रकारों में वेक्टर की अभिव्यक्ति को निर्देशित करता है। हालांकि, क्रे-लोक्स पुनर्संयोजन के माध्यम से, एएवी संरचनाओं को न्यूरॉन लेबलिंग 4,5,6,7के लिए अधिक विशिष्टता के साथ तैनात कियाजाताहै। ध्यान दें, एएवी वैक्टर में पैक किए गए फोटोएक्टिवेटेड माइक्रोबियल ऑप्सिन और फ्लोरेसेंस प्रोटीन को विभिन्न न्यूरॉन उपप्रकार8में व्यक्त किया जा सकता है, और इमेजिंग, न्यूरॉन-प्रकार सर्किट ट्रेसिंग और फोटोमॉडुलेशन9,10के लिए आदर्श हैं।
AAVs एक मस्तिष्क क्षेत्र (या नाभिक) में स्टीरियोटैकली इंजेक्शन का निर्माण सोमा, डेंड्राइट, और एक्सॉन टर्मिनलों में रिपोर्टर प्रोटीन की अभिव्यक्ति ड्राइव करता है। एएवी की तंत्रिका अभिव्यक्ति एक रिपोर्टर जीन (ईवाईएफपी) को शरण देने से न्यूरॉन सेल निकायों की लेबलिंग और अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों11 , 12,13,14से अनुमानों का शारीरिक पता लगाने में सुविधा होती है । एएवी-ईवाईएफपी प्रकाश नियंत्रित ऑप्सिन (जैसे, एचएचआर 2) को ले जाने वाले निर्माणों को वीवो16में मस्तिष्क क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए तंत्रिका अनुमानों के इमेजिंग6,15 और उत्तेजना आधारित शारीरिक ट्रेसिंग के लिए एक उपकरण के रूप में तैनात किया जा सकता है। एएवी सेरोटाइप के आधार पर, न्यूरॉन लेबलिंग की दिशा एंटेरोग्रेड या प्रतिगामी11,12हो सकती है। पिछले अध्ययनों से यह सिद्ध हुआ है कि AAV5 न्यूरॉन्स12में एंटीरोग्रेडी यात्रा करता है । इस प्रकार, एचसीआर 2 व्यक्त करने वाले कोशिका निकायों की फोटोस्मिमुलेशन मस्तिष्क (लक्ष्य)17में कहीं और प्रेसिनैप्टिक प्रभाव पैदा करता है।
यहां, CaMKIIα प्रमोटर के साथ एएवी (सेरोटाइप 5) का उपयोग वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स और अक्षीय अनुमानों में eYFP (रिपोर्टर) और एचएचआर 2 (ऑप्सिन) व्यक्त करने के लिए किया गया था। इस अध्ययन के परिणाम सीए1, सीए 3 और डीजी हिप्पोकैम्पल क्षेत्रों में वीटीए-ग्लूटामेट प्रेसिनैप्टिक टर्मिनलों के परत-निर्भर वितरण को प्रदर्शित करते हैं। इसके अलावा, वीटीए ग्लूटामेट न्यूरॉन्स की फोटोटिमुलेशन ने बेसलाइन मूल्यों की तुलना में वीवो में CA1 मल्टी-यूनिट और सिंगल-यूनिट फायरिंग दरों में वृद्धि की। यह प्रोटोकॉल किफायती उपकरणों और व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग करता है जो तंत्रिका सर्किट ट्रेसिंग प्रयोगों से प्राप्त डेटा की गुणवत्ता को बढ़ा सकता है।
पिछले एक दशक में, एएवी निर्माण का डिजाइन काफी उन्नत हो गया है। इस प्रकार, बेहतर ट्रांसफेक्शन विशिष्टता14के लिए एएवी सेरोटाइप की एक सरणी में अधिक न्यूरॉन-विशिष्ट प्रमोटरों को शामिल किया गया है।…
The authors have nothing to disclose.
यह काम OOM को दिए गए सीबीएस ब्रिजिंग ग्रांट द्वारा वित्त पोषित किया जाता है। OOM, PAA, और के रूप में अध्ययन डिजाइन और प्रयोगों का प्रदर्शन किया । के रूप में और PAA परिणामों का विश्लेषण किया । OOM और PAA पांडुलिपि तैयार की। हम हमारे उपयोग के लिए एएवी उपलब्ध कराने के लिए डॉ कार्ल डिसेरोथ (स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय) को धन्यवाद देते हैं।
3% Hydrogen peroxide | Fisher chemical | H312 | |
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP | Addgene | Plasmid #26969 | |
BNC cable | Amazon | ||
BNC Splitter | Amazon | ||
Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. | Thorlabs | ADAL1-5 | |
Drill | Dremel | LR 39098 | |
Gelatin coated slides | Fisher scientific | OBSLD01CS | |
Hamilton's syringe (Neuros) | WPI Inc. | 06H | |
Head stage adapter | Neuronexus | Adpt-Q4-OM32 | |
High impedance silicon probe | Neuronexus | Q1x1-tet-5mm-121-CQ4 | |
INTAN 512ch Recording Controller | INTAN | RHD2000 | |
Iodine solution | Dynarex | 1425 | |
Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-25 | |
Ketamine | Spectrum | K1068 | |
LED Driver | Thorlabs | LEDD1B | |
LED light source (470 nm)-blue light | Thorlabs | M470F3 | |
Micromanipulator | Narishige | M0-203 | |
Optic fiber | Thorlabs | CFMLC14L05 | |
Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) | Amazon | M0.6 X 2mm | |
Pre-amplifier headstage (32 Channel) | INTAN | C3314 | |
Stereotaxic frame | Kopf | 1530 | |
TTL pulser | Prizmatix | 4031 | |
Urethane | Sigma | U2500 | |
Xylazine | Alfa Aesar | J61430 | |
Software | Company | Version | |
Graphpad Prism | |||
Intan Recording Controller | |||
Neuroexplorer | |||
Plexon Offline Spike Sorter | |||
ACSF Composition: | |||
oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose). |