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신경과학

海馬の腹側テグメンタル領域グルタミン酸末端のインビボ解剖学的および機能的なトレース

Published: September 09, 2020
doi:
10.3791/61282
, ,
1Department of Comparative Biomedical Sciences,Louisiana State University School of Veterinary Medicine

Summary

現在のプロトコルは、海馬への腹側テグメンタル領域(VTA)グルタミン酸突起をトレースするための簡単な方法を示しています。VTAグルタミン酸ニューロンの光刺激をCA1記録と組み合わせて、VTAグルタミン酸末端が生体内での推定ピラミッド発火率を調節する方法を示した。

Abstract

脳内のニューロン亜集団の光遺伝学的調節は、研究者が生体内およびex vivoで神経回路を解剖することを可能にした。これは、神経回路内のニューロンタイプの役割と、学習に対する情報符号化におけるその重要性を決定するための前提となる。同様に、この方法は、目覚めおよび麻酔動物における2つ以上の接続された脳領域の生理学的意義を試験するために使用することができる。現在の研究は、VTAグルタミン酸ニューロンが麻酔をかけマウスのCA1(海馬)における推定ピラミッド型ニューロンの発火率をどのように調節するかを示している。このプロトコルは、海馬の層内のVTAシナプス前グルタミン酸末端のトレースのためのVTAグルタミン酸ニューロンのアデノ関連ウイルス(AAV)依存的標識を採用する。AAVベクターに収容された光制御オプシン(チャネロドプシン;hChR2)および蛍光タンパク質(eYFP)の発現は、VTAグルタミン酸末端の前向きのトレースを許可し、VTAグルタミン酸ニューロン細胞体(VTA)の光刺激を認めた。高インピーダンスの急性シリコン電極をCA1に配置し、生体内でのVTA光刺激に対するマルチユニットおよび単一ユニットの応答を検出した。この研究の結果は、海馬(CA1、CA3、およびDG)におけるシナプス前VTAグルタミン酸末端の層依存分布を示す。また、VTAグルタミン酸ニューロンの光刺激は、生体内の推定CA1錐体単位の発火およびバースト速度を増加させた。

Introduction

過去10年間で、ニューロン型変調の特異性を高めるための遺伝的ツールの配列が開発され、複雑なニューラルネットワーク1のマッピングが行われました。特に、神経細胞に感染し、複製する固有の能力を持つ神経刺激性ウイルスは、ニューロンサブタイプの特定のタンパク質を発現またはアブレートするために展開されています。蛍光タンパク質または遺伝的にコードされたシナプス活性指標を収容する場合、トランスフェクトされたAAVベクターは脳領域を横切るニューラルネットワークを標識および線引きする2,3。AAV構築物におけるプロモーターの選択は、ある程度の特異性(プロモーター依存性発現)を有するニューロン型におけるベクターの発現を指示する。しかし、Cre-loxの組換えを通じて、AAV構築物は、ニューロン標識4、5、6、7に対するより大きな特異性で展開される。注目すべきは、AAVベクターにパッケージ化された光活性化された微生物オプシンおよび蛍光タンパク質は、各種ニューロンサブタイプ8で発現することができ、かつ、イメージング、ニューロン型回路トレース、および光変調9,10に最適である。

AAVは、脳領域(または核)に立体的に注入され、ソーマ、樹状突起、軸索末端におけるレポータータンパク質の発現を駆動する。レポーター遺伝子(eYFP)を収容するAAVの神経発現は、ニューロン細胞体の標識化を促進し、他の脳領域11、12、13、14との間の突起の細胞細胞体および解剖学的トレースを促進する。光制御されたオプシン(例えば、hChR2)を担うAAV-eYFP構築物は、ビボ16における脳領域を標的とする神経投影の画像6、15および刺激ベースの生理学的トレース用のツールとして展開することができる。AAV血清型に応じて、ニューロン標識の方向は、前向きまたは逆行性11、12であってもよい。これまでの研究では、AAV5がニューロン12で前向きに移動することを確立しています。このように、hChR2を発現する細胞体の光刺激は、脳内の他の場所でシナプス前効果を生じる(標的)17。

ここで、AAV(血清型5)を用いて、CaMKIIαプロモーターを用いて、VTAグルタミン酸ニューロンおよび軸索突起においてeYFP(レポーター)およびhChR2(オプシン)を発現させた。この研究の結果は、CA1、CA3、およびDG海馬領域におけるVTA-グルタミン酸シナプス前末端の層依存分布を示す。また、VTAグルタミン酸ニューロンの光刺激は、ベースライン値と比較した場合に、生体内でのCA1マルチユニットおよび単一ユニットの発火率を増加させた。このプロトコルは、ニューラル回路トレース実験から得られるデータの品質を向上させることができる、手頃な価格のツールと市販のソフトウェアを利用しています。

Protocol

すべての実験および動物の取り扱い手順は、ルイジアナ州立大学獣医学部の施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。 1. 実験動物 5~6週齢のマウスを使用してください。 12時間交互の光と暗いサイクルの標準的な条件の下でケージごとに3〜5匹の動物を収容する。食べ物と水は、アドリビタムを提供する必要があります。 <p class=…

Representative Results

順次トレース AAV発現は、注射後21日目のC57BL/6マウスのVTAにおけるレポータータンパク質(eYFP)の免疫蛍光イメージング(eYFP)によって検証された(図2)。海馬におけるシナプス前VTAグルタミン酸突起の前向き標識化に成功したDG、CA3、CA1の層におけるeYFP検出によっても検証された(図6a–d;ムービー 2 と 3. …

Discussion

過去10年間で、AAV構造の設計は大幅に進歩しました。このように、より多くのニューロン特異的プロモーターが、改善されたトランスフェクション特異性14のためのAAV血清型の配列に組み込まれている。蛍光タンパク質、トランスポーター、受容体、イオンチャネルの遺伝子を組み合わせることで、イメージング、神経変調、シナプス活性検出用のAAVライブラリが存在するよ…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、OOMに授与されたCBSブリッジンググラントによって資金提供されています。OOM、PAA、およびASは、研究を設計し、実験を行いました。ASとPAAは結果を分析した。OOMとPAAは原稿を準備しました。AAVを利用できるようにしてくれたカール・ディスセロス博士(スタンフォード大学)に感謝します。

Materials

3% Hydrogen peroxide Fisher chemical H312
AAV-CaMKIIα-ChR2-eGYP Addgene Plasmid #26969
BNC cable Amazon
BNC Splitter Amazon
Ceramic Split Mating Sleeve for Ø1.25mm Ferrules. Thorlabs ADAL1-5
Drill Dremel LR 39098
Gelatin coated slides Fisher scientific OBSLD01CS
Hamilton's syringe (Neuros) WPI Inc. 06H
Head stage adapter Neuronexus Adpt-Q4-OM32
High impedance silicon probe Neuronexus Q1x1-tet-5mm-121-CQ4
INTAN 512ch Recording Controller INTAN RHD2000
Iodine solution Dynarex 1425
Isoflurane Piramal NDC 66794-017-25
Ketamine Spectrum K1068
LED Driver Thorlabs LEDD1B
LED light source (470 nm)-blue light Thorlabs M470F3
Micromanipulator Narishige M0-203
Optic fiber Thorlabs CFMLC14L05
Pan head philips screw (M0.6 X 2mm) Amazon M0.6 X 2mm
Pre-amplifier headstage (32 Channel) INTAN C3314
Stereotaxic frame Kopf 1530
TTL pulser Prizmatix 4031
Urethane Sigma U2500
Xylazine Alfa Aesar J61430
Software Company Version
Graphpad Prism
Intan Recording Controller
Neuroexplorer
Plexon Offline Spike Sorter
ACSF Composition:
oxygenated ACSF with 95% Oxygen/5%CO2 constantly being bubbled through the ACSF (ACSF; in mM 125 NaCl, 25 NaHCO3, 3 KCl, 1.25 NaH2PO4, 1 MgCl2, 2 CaCl2 and 25 Glucose).
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Shrestha, A., Adeniyi, P. A., Ogundele, O. M. Combined In Vivo Anatomical and Functional Tracing of Ventral Tegmental Area Glutamate Terminals in the Hippocampus. J. Vis. Exp. (163), e61282, doi:10.3791/61282 (2020).
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