Summary
Ce travail présente une méthode de microscopie qui permet l’imagerie en direct d’une seule cellule d’Escherichia coli pour l’analyse et la quantification du comportement stochastique des circuits génétiques synthétiques.
Abstract
Le protocole développé ici offre un outil pour permettre le suivi informatique de la division Escherichia coli et des niveaux fluorescents sur plusieurs heures. Le processus commence par le dépistage des colonies qui survivent sur un minimum de médias, en supposant que seul Escherichia coli hébergeant le plasmide correct sera en mesure de prospérer dans les conditions spécifiques. Étant donné que le processus de construction de grands circuits génétiques, nécessitant l’assemblage de nombreuses parties d’ADN, est difficile, les composants du circuit sont souvent répartis entre plusieurs plasmides à différents numéros de copie nécessitant l’utilisation de plusieurs antibiotiques. Les mutations dans le plasmide peuvent détruire la transcription des gènes de résistance aux antibiotiques et interjecter avec la gestion des ressources dans la cellule menant à la nécrose. La colonie sélectionnée est fixée sur une boîte de Pétri à fond de verre et quelques plans de mise au point sont sélectionnés pour le suivi de la microscopie dans les domaines lumineux et fluorescents. Le protocole maintient la mise au point de l’image pendant plus de 12 heures dans des conditions initiales qui ne peuvent pas être réglementées, créant quelques difficultés. Par exemple, les cellules mortes commencent à s’accumuler dans le champ de concentration des lentilles après quelques heures d’imagerie, ce qui provoque l’accumulation de toxines et le signal de flou et de décomposition. L’épuisement des nutriments introduit de nouveaux processus métaboliques et entrave la réponse souhaitée du circuit. La température de l’expérience abaisse l’effectivité des inducteurs et des antibiotiques, ce qui peut endommager davantage la fiabilité du signal. Le gel média minimal rétrécit et sèche, et par conséquent la mise au point optique change au fil du temps. Nous avons développé cette méthode pour surmonter ces défis dans Escherichia coli, similaire aux travaux précédents développant des méthodes analogues pour d’autres micro-organismes. En outre, cette méthode offre un algorithme pour quantifier le bruit stochastique total dans les cellules inchangées et altérées, constatant que les résultats sont compatibles avec les prédictions de l’analyseur de flux comme le montre un coefficient de variation similaire (CV).
Introduction
La biologie synthétique est un domaine multidisciplinaire qui a émergé au cours de la dernière décennie et vise à traduire les principes de conception d’ingénierie en conception biologique rationnelle1,2,3, dans un effort pour atteindre l’intégration multi-signaux et le traitement dans les cellules vivantes pour comprendre la science fondamentale4,5, diagnostic, thérapeutique et biotechnologique applications6,7,8,9,10. Notre capacité à quantifier la réponse intrant-sortie des circuits génétiques synthétiques a été révolutionné par les progrès récents de la technologie unicell cellules, y compris l’analyseur de flux et l’imagerie cellulaire vivante à l’aide de la microscopie automatisée time-lapse11. Un analyseur de flux est souvent utilisé pour mesurer la réponse de ces circuits àl’état stable 1,12, et la microscopie inversée est utilisée pour mesurer la réponse dynamique des circuits génétiques synthétiques au niveau d’une seule cellule3. Par exemple, l’un des premiers travaux en biologie synthétique a impliqué la construction de réseaux d’oscillateurs génétiques dans les cellules vivantes à l’aide de boucles de rétroaction négatives avecun retard de 3. Plus tard, les circuits oscillateurs génétiques ont été appliqués pour comprendre le contrôle métabolique dans l’environnement dynamique des cellules vivantes4. La microscopie automatisée en accéléré est une méthode pour caractériser ces circuits. Nous émettons l’hypothèse que les cellules hôtes, Escherichia coli,se synchronisent lors de la formation de micro-colonies, permettant la mesure du signal et le calcul du bruit sans suivre les relations mère-fille exactes.
Le bruit est un aspect fondamental et inhérent des systèmes biologiques qui proviennent souvent de sources multiples. Prenons, par exemple, les réactions biochimiques impliquant des signaux provenant du transport de porteurs aléatoires discrets tels que la diffusion des protéines13. Ces signaux se propagent avec des fluctuations aléatoires14. D’autres sources de bruit sont la disponibilité des ressources, la division cellulaire et les variations des conditions environnementales telles que la température, l’humidité et la pression. Les signaux biologiques qui se propagent dans les circuits génétiques synthétiques ont souvent un rapport signal/bruit très faible (SNR), ce qui perturbe les performances de ces circuits. Par conséquent, la conception des circuits génétiques demeure l’un des aspects les plus difficiles du géniegénétique 15. Par exemple, contrairement à la plupart des approches qui ne calculent que l’expression moyenne des gènes (mesurée sur l’ensemble de la population cellulaire), la variance du signal mesuré est prise en compte afin de concevoir un comportement prévisible par le biais de réseaux génétiquessynthétiques 12. En tant que tel, les niveaux de variabilité ou de bruit dans l’expression des protéines jouent un rôle dominant dans la conception et la performance des circuitsgénétiques analogiques et numériques 1,16,17.
De nombreuses approches ont été développées pour quantifier la variabilité cellule à cellule, y compris chez Escherichia coli3,7,18. Ces méthodes sont souvent utilisées pour étudier l’activation des gènes et les voies métaboliques, mais avec moins d’accent sur l’étude de la dynamique du bruit stochastique, comme la mesure et le démêlage de sources sonores spécifiques, en particulier pour les circuits génétiques dans les cellules vivantes où il s’agit d’un défifondamental 19,20,21. Plusieurs facteurs, hérités du circuit lui-même (intrinsèques) et dérivés des cellules hôtes (extrinsèques), peuvent perturber la performance continue des circuits génétiques. Dans cet article, nous avons développé un protocole qui vise à quantifier le bruit total dans les cellules d’Escherichia coli, y compris les sources de bruit intrinsèques et extrinsèques6,22. En quantifiant le bruit total, puis en évaluant le SNR23, la conception des circuits génétiques peut être améliorée. Cette méthode peut être modifiée pour mesurer séparément des sources sonores indépendantes, en surveillant plusieurs protéines fluorescentes6,20. Pour le protocole décrit ici, nous maintenez les conditions environnementales bien contrôlées et mesurons continuellement l’activité des cellules sans l’influence de facteurs externes. Nous mesurons le signal des protéines fluorescentes dans les cellules simples au fil du temps et les entions simultanément sous un substrat agarose. Les images qui en résultent sont analysées à l’aide du MATLAB personnalisé du laboratoire.
Idéalement, la mesure continue de l’activité en temps réel des protéines fluorescentes à l’intérieur d’une cellule produira des données précises grâce à la croissance et à la division des cellules. Toutefois, il est difficile d’acquérir de telles données. Cela est dû à la dégradation des protéines fluorescentes, connues sous le nom de photo-blanchiment7, quand ils sont exposés aux radiations dans le processus d’excitation. En outre, les cellules Escherichia coli sont également sensibles à l’excitation, ce qui pourrait conduire à la phototoxicité7. Les deux émissions limitent la quantité de cadres photo qui peuvent être acquis et le temps entre les acquisitions. Le substrat et les types moyens (p. ex., bouillon de lysogène) utilisés pour faire croître les cellules pendant l’imagerie jouent également un rôle essentiel. Nous recommandons fortement d’utiliser un milieu minimal, ce qui minimise le fond non fluorescent et prolonge le temps de division cellulaire.
De plus, l’échantillon doit être préparé en tenant compte des exigences suivantes (1) Le faible taux de division cellulaire permet des expositions moins fréquentes pour l’imagerie étroite du cycle de division et la réduction de la probabilité de phototoxicité et de photobleaching. Nous avons fixé le temps d’acquisition à environ la moitié du temps prévu de mitose (2) La faible densité cellulaire au début de l’expérience permet une meilleure uniformité et une meilleure traçabilité de la division. La densité cellulaire est affectée par le rapport de dilution des cellules d’Escherichia coli, qui est un paramètre significatif pour le succès de ce protocole et doit être déterminé pour chaque laboratoire. Afin d’établir le ratio, chaque nouvelle souche ou média Escherichia coli utilisé devrait être équipé de graphiques du taux de croissance(figure supplémentaire 1). Un rapport approprié a été atteint si les cellules peuvent se développer sans secousse supplémentaire après une courte incubation à partir d’une densité initiale d’environ600 nm OD = 0,1. Les cellules à cette phase se diviseront selon la température ambiante seulement (3) Restriction du mouvement cellulaire : le mouvement cellulaire dépend fortement de la fermeté du substrat (coussin agarose). La fermeté du substrat dépend de la quantité totale d’agarose et du temps de solidification du gel. Les gels ne peuvent pas être laissés pour se solidifier pendant la nuit à température ambiante, car l’Escherichia coli subira une mitose. D’autres facteurs qui influent sur la stabilité du substrat comprennent la quantité d’eau dans l’échantillon et l’humidité. D’autres questions sont examinées en détail dans les résultats représentatifs. Ce protocole fournit de nombreux détails et se déplace progressivement d’une étape à l’autre. Le protocole offre une longue stabilité pour les expériences d’imagerie et fournit un outil de traitement d’image de base.
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Protocol
1. Préparation des médias et de la culture
- Préparer une solution de stock de 1 000 x carbenicilline (50 mg/mL) ou antibiotique pertinent.
- . Peser 0,5 g de carbenicilline. Ajouter 10 mL de H2O stérile. Dissoudre complètement.
- Stériliser le stock de carbenicilline à l’intermédiaire d’un filtre à seringues de 0,22 μm. Aliquot la solution antibiotique et stocker à -20 °C.
- Pour préparer des assiettes de bouillon de lysogène (LB), mélanger 5 g de tryptone, 5 g de NaCl, 2,5 g d’extrait de levure et 7,5 g d’agar Bacto avec 0,5 L de H2O. Autoclave stérile la solution à 121 °C pendant 20 min.
- Plonger partiellement le mélange de gel fondu dans un bain d’eau de 50 °C. Ajouter 1 000 μL de carbenicilline (50 mg/mL).
- Préparez des boîtes de Pétri dans un environnement stérile. Laisser les assiettes à régler avant de les stocker au réfrigérateur.
- Pour les supports minimaux M9, préparez des solutions de stock distinctes des éléments suivants : sels 5x M9 (56,4 g/L), 2 M de glucose et 2 % d’acides casamino sans biotine. Autoclave les solutions à 121 °C pendant 20 min.
- Pour préparer 5 assiettes de Petri, mélanger 1125 mg d’agar à faible fusion et 400 mg d’agar avec 89,2 mL de média minimal (1x M9). Ajouter 10 mL de 2% d’acides casaminos (2% [vol/vol]) dans un flacon Erlenmeyer de 250 mL.
REMARQUE : Assurez-vous de verser les supports sur les lèvres intérieures du flacon. - Micro-ondes de la solution en rafales courtes de 3 à 4 secondes. Répétez jusqu’à ce que la solution soit claire.
REMARQUE : Assurez-vous de ne pas atteindre le point d’ébullition. - Placer la fiole Erlenmeyer de 250 mL dans un bain d’eau chaude (60 °C) pour mélanger davantage par diffusion, et laisser refroidir jusqu’à ce que sa température tombe à environ 45-50 °C.
- Allumez la flamme sur le banc de coulée de plaques.
- Ajoutez rapidement toutes les solutions dans l’ordre suivant :
800 μL de 50% de glycérol (0,4% [vol/vol])
100 μL de thiamine (B1)
1100 μL de glucose (2M)
100 μL de carbenicilline (50 mg/mL). - Faites tourbillonner la fiole Erlenmeyer pour assurer une distribution uniforme de tous les ingrédients dans l’ensemble de l’agar.
- Ouvrez une assiette à la fois à côté de la flamme et commencez à couler.
- Laisser les assiettes sur le banc pendant quelques minutes jusqu’à la solidification initiale.
- Retournez les plaques à l’envers pour empêcher la condensation de l’eau de s’insruger sur le gel.
- Laisser les assiettes se solidifier à température ambiante pendant environ 2 h.
- Une fois que les plaques se sont solidifiées et séchées, elles peuvent être conservées à 4 °C pendant environ 3 mois.
2. Construction de souches bactériennes et de plasmides
NOTE: Le circuit génétique contient une partie; une protéine fluorescente verte (GFP) entraînée par un promoteur PtetO résultant en une expression constitutive. Tous les plasmides de ce travail ont été construits en utilisant des techniques de clonage moléculaire de base et ont été transformés en Escherichia coli 10β, en utilisant un protocole standard de chocthermique 24. La construction finale a été transformée en souche de type sauvage Escherichia coli MG1655 pour analyse.
- Transformez le plasmide désiré en cellules Escherichia coli MG1655 avec le protocole standard de choc thermique24.
- Faire pousser les cellules transformées sur une plaque d’agar LB pendant la nuit à 37 °C.
REMARQUE : Il est possible de garder les boîtes de Petri de l’étape 2.2 jusqu’à 3 jours pour l’utilisation de microscopie. - Inoculer une seule colonie en 5 mL de bouillon LB complété par les antibiotiques pertinents dans un tube de verre.
- Faire pousser les cellules à 37 °C avec une vitesse de secousse de 250 rpm dans l’incubateur pendant 2 h jusqu’à ce que le liquide soit nuageux.
- Préparez 1 mL de solution de dilution comme suit :
892 μL de supports minimants (1x M9)
8 μL de 50% de glycérol (0,4% [vol/vol])
100 μL de 2% d’acides casaminos (0,2% [wt/vol])
1 μL de thiamine (B1)
11 μL de glucose (2 M)
1 μL d’antibiotiques pertinents- Mélanger et faire tourner vers le bas.
- Diluer la culture cellulaire (1:30) de l’étape 2.4 dans un tube de 2 mL en ajoutant 30 μL de croissance d’Escherichia coli à 1000 μL de solution de dilution (étape 2.5).
- Incuber le tube pendant 1 h en secouant (250 rpm) à 37 °C.
- Faire pousser 40 μL - 60 μL sur les plaques M9 préparées à l’étape 1.10. Incuber la plaque à 37 °C pendant la nuit.
REMARQUE : La densité optique (OD600nm)pour le placage devrait être d’environ 0,1. - Placez jusqu’à trois plaques de fond en verre de 35 mm sur le banc.
REMARQUE : Assurez-vous que le verre de la plaque a la bonne épaisseur pour les lentilles de microscope utilisées. - Préparer la culture pour l’ensemencement sur des plaques de gel, répéter les étapes 2,3 à 2,6 pour les colonies à partir de plaques préparées à l’étape 2.9 mesures au microscope.
- Préparez la solution suivante pour faire trois plaques de microscope.
- Préchauffer le bain d’eau à 60 °C.
- Mélanger 112,5 mg d’agar à faible fusion et 40 mg d’agar avec 8,92 mL de médias minimaux (1x M9) et ajouter 1 mL d’acides casaminos à 2 % (0,2 % [vol/vol]) dans une fiole Erlenmeyer de 25 mL.
REMARQUE : Assurez-vous de verser les supports sur les lèvres intérieures du flacon.
- Micro-ondes de la solution en rafales courtes de 2 à 3 secondes. Répétez jusqu’à ce que la solution soit claire.
REMARQUE : Assurez-vous de ne pas atteindre le point d’ébullition. - Placer la fiole Erlenmeyer de 25 mL dans un bain d’eau chaude (60 °C) pour le mélanger davantage par diffusion, et laisser refroidir sur le banc jusqu’à ce que sa température tombe à environ 45-50 °C.
3. Préparation de coussinets d’agarose
- Banc propre avec 70% d’éthanol. Stretch tape sur le banc nettoyé. Assurez-vous que le ruban est lisse et nivelé.
- Préparez deux coverslips : l’un sur bande et l’autre à proximité. Préparer une couverture.
- Retirer le flacon (préparé à l’étape 2.14) du bain d’eau, essuyer l’extérieur du flacon propre et laisser refroidir jusqu’à ce que sa température tombe à environ 45-50 °C.
- Pour faire la solution gel, mélanger rapidement toutes les solutions dans l’ordre suivant :
80 μL de 50% de glycérol (0,4% [vol/vol])
1 mL de 2% d’acides casaminos (0,2% [wt/vol])
10 μL de thiamine (B1)
110 μL de glucose (2 M)
10 μL d’antibiotiques pertinents. - Verser 1,5 mL de gel sur le coverslip et le couvrir de la deuxième pièce faisant un « sandwich ».
- Remettre l’Erlenmeyer au bain d’eau chaude. Couvrir le sandwich avec le couvercle et régler la minuterie pendant 20 minutes.
- Dans le même temps, incuber le tube de l’étape 2.11 pendant 1 h à 37 °C avec secousses (250 rpm)
- Après 20 minutes, retourner le sandwich (étape 3.5), le couvrir et laisser reposer pendant 1 h.
REMARQUE : Pour de meilleurs résultats, laissez reposer le « sandwich » à 4 °C pendant toute la durée de l’étape 3.8. - Ensemencer la culture d’Escherichia coli à partir de l’étape 3.7 en pipetant l’échantillon sur le plat de 35 mm.
REMARQUE : Le pipetting 6 μL des cellules comme petites gouttes séparées donne les meilleurs résultats. - Laisser sécher les gouttes, pendant au moins 15 minutes et jusqu’à 30 minutes.
- Exposez le gel solidifié du sandwich de l’étape 3.8 en glissant le coverslip loin.
- Couper le sandwich en petits coussinets individuels avec un poinçon ou une pointe de biopsie.
- Penchez-le doucement sur l’échantillon (étape 3.9). Laisser le plat pendant 20 minutes sur le banc.
4. Préparation de l’échantillon pour l’imagerie par microscopie
- Retirer le flacon du bain d’eau de l’étape 3.6. Essuyer l’extérieur du flacon propre et laisser refroidir à température ambiante (25 °C).
REMARQUE : Retirez le flacon à l’étape 4.1 environ 3 minutes avant la fin de la minuterie. - Verser 3 mL de gel constamment au périmètre de la plaque dans un mouvement circulaire. Laisser solidifier pendant quelques minutes.
- Sceller les plaques avec du ruban adhésif et percer plusieurs trous avec une aiguille de 25 G. Retourner tous les plats pour éviter que la condensation de l’eau ne coule sur le gel.
- Incuber tous les plats à 4 °C pendant 30 min pour permettre une solidification complète tout en empêchant la mitose cellulaire.
REMARQUE : Laissez les échantillons à 4 °C pour les mesures successives, pas plus d’une journée. - Démarrez le microscope par instructions du fabricant.
- Trouvez la mise au point initiale à l’aide de l’objectif d’amplification le plus bas et engagez le système de mise au point automatique (AFS).
- Utilisez de l’huile si nécessaire, noyez la lentille avec de l’huile et étalez-la soigneusement en déplaçant la plaque avec un contrôleur de plate-forme (pas manuellement) et AFS peut être engagé à nouveau.
- Utilisez la section transversale relative dans la direction Z, suite à la suggestion par défaut pour les sections transversales z step.
REMARQUE : Nous avons pris des images de champ lumineux toutes les 5 minutes et des images fluorescentes toutes les 20 minutes. Parfois, la mise au point doit être ajustée pendant les 30 premières minutes. Préchauffer la boîte d’incubateur de microscope et l’huile, tout en réfrigérant l’échantillon tend à aider à réduire la perte initiale de concentration.
5. Analyse des données
REMARQUE : Afin de traiter les données de microscopie, nous avons conçu un logiciel informatique dans MATLAB. Ce logiciel facilite l’identification des limites cellulaires à partir d’images et de segments de tiff de champ lumineux et trie les cellules par zone. La sortie de cette analyse d’image peut être utilisée comme masque sur des images fluorescentes de tiff pour dériver des niveaux d’intensité cellulaire et annuler des artefacts dans le domaine fluorescent tel que le halo cellulaire dû aux limites de résolution de microscope. Le logiciel développé a été inspiréd’œuvres similaires 7,25,26,27,28,29,30 et fournit une solution élégante adaptée pour le laboratoire.
- Tout d’abord, définissez les paramètres suivants dans main_code.m.
- Définissez le dossier des images d’acquisition.
- Définissez la période de temps d’image - étape de temps de canal de champ lumineux en minutes.
- Définir la fréquence GFP - taux d’acquisition d’images GFP.
- Définir la résolution du microscope (c.-à-d. combien de pixels équivaut à 1 μm).
- Décrivez histogramme bin range - cell area range.
REMARQUE : Le processus de classification des données en fonction de la zone cellulaire est similaire aux principes de l’analyse des données de cytométrie du flux. Des barrières sont placées autour des populations de cellules avec des caractéristiques communes, généralement dispersées vers l’avant dispersées et dispersées latéralement, pour isoler et quantifier ces populations d’intérêt. La microscopie permet d’examiner, d’étudier et de quantifier plusieurs groupes cellulaires. - Définir le noyau de convolution (3,3) - ce paramètre détecte les limites cellulaires par seuil global (count_cells.m).
REMARQUE : Cette configuration n’est nécessaire que lors de la modification du laboratoire ou du microscope. Le logiciel nécessite que le canal de champ lumineux d’entrée soit étiqueté avec index c1, canal de fluorescence étiqueté comme c2.
- Exécutez main_code.m, qui exécutera tous les autres scripts automatiquement( count_cells.m, cell_growth_rate.m).
- Programme segmente automatiquement les images de champ lumineux (voir figure supplémentaire 2-4).
- Combinez l’image de segmentation avec l’image fluorescente (GFP) pour extraire le niveau d’intensité par cellule.
- Calculer le graphique de la quantité de cellules par temps et s’adapter en fonction de la croissance exponentielle.
- Calculer l’écart moyen et type (MT) pour chaque plage de zone cellulaire.
- Calculer le rapport signal/bruit (SNR) pour chaque plage de zone cellulaire.
- Tracer et adapter la distribution de la quantité de cellules par intensité.
- Calculez le coefficient de variance (CV) et comparez aux données de l’analyseur de flux.
REMARQUE : Le logiciel donnera en tant que sortie les images de segmentation finales pour ajuster conv_kernel dans un nouveau dossier " yourfolder/Segmenté « . Le logiciel donnera comme sortie les graphiques dans un nouveau dossier « yourfolder/Graphs.
- Afin de comparer entre les expériences, utilisez compare_experiments.m.
- Définissez les répertoires pour les graphiques enregistrés et l’adresse du répertoire \CompareResult.
- Exécutez le fichier.
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Representative Results
Le logiciel analyse les images de domaine de champ lumineux qui sont hors-blanc et noir. L’Escherichia coli ressemblera à des formes oblongues noires sur un fond blanc éteint et une plage dynamique de luminance devrait montrer une pointe en son centre (Figure 1). Dans les images fluorescentes, les cellules peuvent avoir un petit halo, mais les cellules individuelles aux formes oblongues peuvent encore être résolues. Un événement de mitose doit d’abord être détecté après 30 minutes. La mise au point au microscope devrait rester stable au fil du temps et bien que les cellules puissent se déplacer lentement pendant ces 30 minutes, il est peu probable qu’elles quittent le champ de vision. Une telle expérience sera considérée comme bonne et peut être vue à la figure 2. Les cellules peuvent être difficiles à détecter dans le domaine des champs lumineux à faible grossissement. Nous recommandons d’établir la distance moyenne de mise au point avec un plasmide à numéro de copie élevé (HCN), car il est facile de le remarquer à faible grossissement. Définissez la distance moyenne tout en mesurant un plasmide à faible nombre de copies (LCN) au grossissement élevé à l’avance. Cette distance de mise au point dépend principalement des plaques, du système de microscopie et de l’huile, et non de l’épaisseur du gel ou de la souche Escherichia coli.
Lors de l’adaptation de ce protocole à d’autres laboratoires, les problèmes suivants peuvent survenir (1) Les plaques d’Escherichia coli (échantillons) préparées à un rapport de dilution incorrect peuvent montrer un nombre immuable de cellules (figure 3 et figure 4) (2) Les échantillons préparés sans sceller la plaque peuvent montrer un rétrécissement excessif. Cela peut être observé à mesure que les cellules dérivent (figure 3) ou causent une perte de concentration (figure 5) (3) Certains échantillons peuvent présenter des cellules « fixes » à déplacement lent (en noir) sur fond de cellules de natation (en blanc). Cela est probablement dû à un échantillon humide et il se stabilise généralement que l’excès d’eau est absorbé par le gel (Vidéo supplémentaire 1) (4) Échantillons qui ne montrent pas de cellules après quelques minutes d’échauffement pourrait avoir été préparé de manière incorrecte, probablement en raison de: (I) Gel a été versé alors qu’encore trop chaud, (II) bouchon protecteur a été oublié, (III) un média minimal n’a pas un ingrédient, (IV) la densité incorrecte des cellules, et (V) gel a été scellé trop serré. Il est important de percer des trous pour permettre l’échange de gaz au détriment du rétrécissement du gel (figure 5) et (VI) cellules peuvent également indent le gel à la recherche de nutriments, empilant l’un sur l’autre, compromettant le monocouche cellulaire empêchant efficacement la détection des cellules et la mesure du signal fluorescent fiable (Figure supplémentaire 5).
Nous avons mesuré trois circuits dans ce travail. Tout d’abord, un promoteur constitutif qui réglemente le PFP indiqué à la figure 6. Deuxièmement, un promoteur constitutif qui réglemente le super-double GFP31 (sfGFP) indiqué dans la figure 7. Une balise de dégradation ssrA (AAV) a été ajoutée à sfGFP pour réduire sa durée de vie à la demi-vie à5 minutes. Le troisième circuit est basé sur un circuit de rétroaction positive1, et est induit par acyl-homoserine-lactone (AHL). Le promoteur PluxR réglemente sfGFP et LuxR, un facteur de transcription liant avec AHL pour activer PluxR comme le montre la figure 8. La figure 9 présente la dynamique de la croissance cellulaire (nombre de cellules par rapport au temps), la figure 10 montre la dynamique du signal mesuré (fluorescence moyenne par rapport au temps), et la figure 11 montre la dynamique du bruit total évalué (écart type (MS) par rapport au temps).
Le SNR (ou CV) est largement utilisé dans la conception de circuits électroniques analogiques pour exprimer la précision et la fiabilité du circuit32. Cv se rapporte à la distribution du signal entre les cellules individuelles et permet la comparaison entre les méthodes et différents équipements tels que les microscopes et les analyseurs de flux. Le calcul du SNR à partir d’images au microscope nous permet de comparer les circuits à travers le temps, les cellules segmentées sont mesurées en même temps que de fournir une mesure pour la résolution spécifique du bruit par rapport au signal, ou un intervalle de bruit pour un temps spécifique et la concentration de l’inducteur. Cela peut indiquer si les cellules détecteurs seront en mesure de résoudre la réponse exacte du signal à la concentration de l’inducteur. Dans ce travail, le CV a été calculé en tenant compte de tous les artefacts segmentés qui sont des cellules, indépendamment de la progression cellulaire dans le cycle de division. SNR a été calculé pour la gamme spécifique de zone cellulaire au fil du temps, puis il a été averaged pour trois expériences répétées. Ni le signal acquis ni la MT ne sont fiables seuls, car ils sont spécifiques à l’expérience et à l’équipement utilisés. Le signal est mesuré à l’aide d’unités arbitraires qui dépendent du gain d’équipement prédéfinit, du détecteur de photos et du temps d’exposition. Les données présentées à la figure 10 suggèrent que l’étape des cellules dans le cycle de division n’affecte pas le niveau de bruit, car différentes plages de surface (points dans le cycle de division) montrent la même tendance. Cette observation pourrait appuyer l’affirmation selon laquelle le suivi des relations mère-fille exactes peut être évité pour mesurer le bruit, ce qui pourrait améliorer le SNR pour la méthode présentée. Aucun changement substantiel n’a été observé entre le PFG et le FPS, comme le montre la figure 12. Nous calculons le SNR (SNR= moyenne/MT) et le présentons à la figure 12 et à la figure 13.
Nous avons ensuite calculé la variance et le CV en fonction des équations suivantes31
1.1
1.2
Lorsque c’est le temps de pliage des protéines, T est le temps de division cellulaire, θ et μ sont le nombre de plasmides avant et après la division, la copie plasmide numéro31. En utilisant les équations ci-dessus (1,1 et 1,2), nous pouvons adapter les données du signal de l’analyseur de flux pour la distribution gamma.
Ensuite, nous avons comparé entre le CV, qui est mesuré et calculé par analyseur de flux (figure 14), et par le protocole (Figure 15).
Figure 1: Image d’exposition au champ lumineux (a) Acquisition stabilisée dans le champ lumineux (b) Image de segmentation, seules les cellules colorées entrent dans les calculs (c) Carte de luminosité pixel de l’acquisition, le pic est le bruit de fond. Seuil par elle segments seulement Escherichia coli. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 :Cette expérience montre de bonnes cellules saines qui se divisent et réagissent après 120 minutes. Les images ont été acquises successivement à intervalles de 20 minutes. Les colonies sont au point, le gel est stable entre les échantillonnages. Les colonies se divisent et produisent des signaux forts. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 :Effets d’un rapport de dilution incorrect et d’un rétrécissement de gel sur l’image fluorescente. Les images ont été acquises à intervalles de 20 minutes (a) Escherichia coli individuel encerclé en rouge (b) La même cellule dérive vers la droite du champ de vision (c) La cellule dérive plus loin. Les cellules ne divisent pas ou ne changent pas non plus de position, probablement en raison d’un faible ratio de dilution et d’un rétrécissement du gel. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 :Dans cette expérience, aucune activité n’a été détectée et presque aucune cellule n’était présente. Les raisons possibles sont le gel étant trop chaud, le séchage de l’échantillon étant trop agressif oun’ayantpas de bouchon de protection ( a ) images fluorescentes prises à 40 minutes (b) images fluorescentes prises à 60 minutes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 5 :Perte de mise au point et photobleaching. Des images successives de (a) à travers (d) ont été acquises à intervalles de temps de 15 minutes en utilisant le système de mise au point automatique. Voir la vidéo supplémentaire 2. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 6:Carte plasmide de Pteto qui régule le GFP. Sans le répresseur TetR, le promoteur PtetO agit comme un promoteur constitutif. Le circuit est cloné sur des plasmides à faible nombre de copies. Ce plasmide sert de base à la mesure du SNR pour tout circuit modifié. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 7:Carte plasmide de Pteto qui régule sfGFP. Le sfGFP est fusionné à une étiquette de dégradation AAV. Le circuit est cloné sur des plasmides à faible nombre de copies. Le sfGFP-AAV est une variante plus robuste de GFP, tandis que l’étiquette AAV le rendant vulnérable à la dégradation par les protéases d’entretien ménager de l’Escherichia coli. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 8 :Carte plasmide du circuit de rétroaction positive. Le circuit est induit par un inducteur AHL, qui lie le facteur de transcription LuxR. Le promoteurP luxR, réglementé par le complexe AHL-LuxR, active la production de LuxR et sfGFP-AAV. Le circuit est cloné sur des plasmides à faible nombre de copies. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 9: Ladynamique de la croissance de la souche Escherichia coli MG1655 dans un média minimal comprend (a)PtetO-GFP, croissance exponentielle d’environ 35 minutes. Les images de cette expérience sont montrées dans la figure 2 (b) PtetO-sfGFP, croissance exponentielle d’environ 35 minutes. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 10 :Niveau d’intensité fluorescente, normalisé par pixel et acquis à intervalles de 20 minutes.
Les cellules sont binées selon la zone, afin de minimiser les artefacts. Les cellules sont divisées par leur zone dans un carré de micromètre (a) Pteto-GFP circuit première répétition pourl’intensité à 210 minutes est de 0,004 a.u (b) PtetO-sfGFP circuit première répétition pour l’intensité à 210 minutes est de 0,022 a.u (c) Signal mesuré du circuit Pteto-GFP (d) Signal mesuré de PtetO-sfGFP circuit. Toutes les données expérimentales représentent la moyenne de trois expériences. Le logiciel peut trier la zone cellulaire à différents groupes (a) et (b) afficher des graphiques pour quatre plages de zone cellulaire représentant le cycle de division. La première zone de 14 micromètres représente les cellules après la division comme les plus susceptibles que les cellules après la division seront les plus petites. La deuxième zone de 21 μm représente les cellules avant la division. Les troisième et quatrième zones représentent les cellules en division car la surface totale est multipliée par deux (29 et 36 μm) afin de considérer les cellules qui ont mis plus de temps à se diviser. Les zones ont été choisies en évaluant manuellement les données à l’aide d’images de microscopie. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 11: Écart type (MT) des intensités de fluorescence à cellules simples pour : a) PtetO-Circuit GFP la première répétition pour les MT à 210 minutes est de 0,001865 a.u (b) P1tetO-sfGFP circuit première répétition pour STD à 210 minutes est de 0,01477 a.u (c) STD de Pteto-GFP circuit (d) STD de PtetO-sfGFP circuit. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 12: SNR d’intensités de fluorescence à cellules simples. Nous calculons le SNR=Mean/STD (a) PtetO-GFP circuit première répétition pour SNR à 210 minutes est de 1.309 a.u (b) PtetO-sfGFP circuit première répétition pour SNR à 210 minutes est de 1.29 a.u (c) Trois répétitions de mesure GFP (d) Trois répétitions de mesure sfGFP. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 13:SNR des intensités de fluorescence à cellules simples (a)PluxR-sfGFP circuit SNR pour la réponse de saturation à AHL (b) PluxR-sfGFP circuit SNR pour la réponse à la mi-temps à AHL. Le SNR de rétroaction positive circuit réglementé AHL est plus élevé que SNR pour le circuit constitutif sfGFP. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 14: Histogrammes des circuits génétiques basés sur l’analyseur de flux : données expérimentales (données bleues) et modèles stochastiques (rouge). L’axe x représente les unités arbitraires de fluorescence de la cytométrie du flux, et l’axe y représente la fréquence des cellules produisant le niveau de fluorescence correspondant. Les données ont été mesurées à l’aide d’un analyseur de débit après trois heures. La fluorescence du GFP a été quantifiée par excitation à une longueur d’onde de 484 nm et émission à une longueur d’onde de 510 nm. Les tensions du filtre PE-TexasRed ont été utilisées sur un échantillonneur à haut débit pour mesurer les niveaux d’expression GFP. Les tensions de l’analyseur de flux ont été ajustées à l’aide d’un logiciel afin que les niveaux d’expression maximum et minimum puissent être mesurés avec les mêmes paramètres de tension. Ainsi, des tensions constantes ont été utilisées à travers chaque expérience entière. Les mêmes tensions ont été utilisées pour les répétitions ultérieures de la même expérience. L’ajustement a été fait par l’utilisation de la distribution gamma31. Cette méthode suppose que le signal dépend principalement de la distribution aléatoire des plasmides (a) Mesure du clone Pteto-GFP sur le plasmide à faible numéro de copie. CV expérimental=0,46, Modèle CV=0,32 (b) Mesure de Pteto-sfGFP-AAV clonée sur plasmide à faible numéro de copie. CV expérimental=0,86, Modèle CV=0,44. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 15: Histogrammes des circuits génétiques basés sur le microscope : données expérimentales (lignes pointillées) et données de modèles stochastiques (lignes solides). L’axe x représente les unités arbitraires de fluorescence du microscope inversé et l’axe y représente la fréquence des cellules produisant le niveau de fluorescence correspondant. Le montage a été fait à l’aide de la distribution gamma MATLAB31,32 (a) Mesure du clone PtetO-GFP sur le plasmide à faible numéro de copie (b) Mesure de PtetO-sfGFP-AAV cloné sur un faible numéro de copie. La comparaison montre que notre protocole obtient des valeurs cv similaires à celles de l’expérience d’analyseur de flux. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure supplémentaire 1: Quatre ratios de dilution, entre 1:500 et 1:20, pour la souche MG1655. Le graphique montre que si la densité initiale est élevée, les nutriments LB sont abondants, ce qui entraîne une division plus rapide des cellules. Pour une dilution de 1:500, la densité cellulaire est restée constante. Pour une dilution de 1:100, la densité cellulaire a augmenté lentement. Pour une dilution de 1:50, la densité cellulaire a augmenté à un taux de division modéré sans délai significatif dans l’incubation de 250 RPM. Pour une dilution de 1:20, la densité cellulaire a atteint la saturation rapidement. Nous avons choisi un ratio de dilution de 1:30, permettant une incubation courte pour atteindre une croissance exponentielle et une plage de division substantielle pour atteindre une saturation élevée à un taux de division modéré. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre
Figure supplémentaire 2 : Traitementdes images de champ lumineux. a) Images brutes d’intensité des données provenant du canal de champ lumineux du système de microscope. b)Manipulation d’amélioration du contraste de l’image pour améliorer la séparation des objets cellulaires de l’arrière-plan. c)Reconnaissancedes limites cellulaires basée sur le filtre de convolution33 et le seuil global basé sur la binarisation34. d)Morphologique35 opérations de fermeture et de remplissage pour identifier les limites des colonies cellulaires. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre
Figure supplémentaire 3: Segmentation de fond de colonie cellulaire\premier plan. Pour minimiser l’impact du bruit, nous essayons d’identifier les limites des colonies cellulaires et de les extraire du bruit du gel. (a) Opération de binarisation d’image sur l’amélioration du contraste basée sur le seuil adaptatif pour détecter les objetscellulaires 36. b)Multiplation matricielle des matrices présentées à S2d et S3a réussissant à filtrer la plupart des bruits et à différecier le bruit du gel des cellules. Certaines limites ne sont pas entièrement résolues. c)Identificationdes limites cellulaires à l’aide d’un algorithmede bassin versant 37 basé sur la transformation de la distance38. d) Multiplation matricielle des matrices présentées à S3b et S3c résolvant avec succès des cellules simples. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre
Figure supplémentaire 4 :Segmentation des cellules simples. (a) Produit segmenté de l’image de champ lumineux. D’autres nettoyages sont préformés en fonction de la zone cellulaire qui se forme et qui rejette les bulles rondes. b) Images de signal de fluorescence acquises au microscope. c)Multiplation matricielle des matrices présentées à S4a et S4b en extrayant avec succès le signal des cellules individuelles. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre
Figure supplémentaire 5: Perte de monomeuse. (a) Image de champ lumineux d’une couche cellulaire à 840 minutes (14 heures) de Pteto qui régule le circuit GFP montré dans la figure 2 dans l’article comme une bonne expérience. Sur le côté droit de la microscopie, la perte d’image du monocouche peut être détectée. b) Image de segmentation logicielle. En raison de la perte de cellules monocouches sont fragmentés et seront nettoyés base sur la zone de gating. c)Image de fluorescence montrant que sur le côté droit de l’image aucune cellule ne peut être résolue et un faible signal de cellules sur le côté gauche de l’image en raison de la perte de monocouche. d) Image de segmentation combinée à l’image de fluorescence. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre
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Vidéo supplémentaire 2. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger cette vidéo
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Count_Cells.m. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier
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Discussion
Dans le cadre de ces travaux, nous avons mis au point un protocole qui permet de retracer par ordinateur les cellules vivantes d’Escherichia coli, en suivant les niveaux de division et de fluo sur une période de plusieurs heures. Ce protocole nous permet de quantifier la dynamique stochastique des circuits génétiques d’Escherichia coli en mesurant le CV et le SNR en temps réel. Dans ce protocole, nous avons comparé les comportements stochastiques de deux circuits différents comme le montre la figure 10. Il a été démontré que les plasmides dont le nombre de copies est faible sont plus sujets aux effets stochastiques et moins affectés par la division cellulaire. Le premier circuit a exprimé constitutivement GFP (Figure 10a), et le deuxième circuit constitutivement exprimé sfGFP fusionné à une étiquette de dégradation ssrA (Figure 10b). Afin de quantifier le comportement stochastique des protéines fluorescentes, nous avons également enregistré les images de champ lumineux. Les résultats montrent que l’expression de GFP, en particulier à sa maturation39, est la source de bruit dominante. Le modèle périodique de comportement dentaire de scie observé dans la figure 10a peut être expliqué par le processus aléatoire de division cellulaire et l’échelle de longue durée de maturation de GFP (~50 minutes). En revanche, le signal sfGFP du deuxième circuit a été stabilisé pendant la mesure, parce que le temps de maturation très court du sfGFP (~6 minutes). Nous avons développé une formule simple qui décrit le niveau de GFP dans les deux circuits lorsque nous considérons seulement le processus de division cellulaire et le temps de maturation GFP. À un moment donné, t , noussupposons qu’il ya x numéros de copie de protéines, et μ numéros de copie des plasmides. Le numéro de copie protéique peut être décrit par :
1.3
1.4
Lors de l’examen que des événements de division; 
après maturation des protéines et donc pour les plasmides spécifiques que nous obtenons:
Pour GFP ( 
): 1,5
Pour sfGFP ( 
):1.6
Puis, la série développée de sfGFP:
1.7
Dans le cas où 
, nous obtenons 
. Ce résultat peut être expliqué comme suit. Lorsque x est petit, les niveaux de SfGFP augmentent d’une petite quantité. Lorsque x est grand, sfGFP est dégradé à un état stable. De même, pour le circuit de GFP, chaque cellule contient environ 10 unités de GFP, mais puisque le temps de maturation pour GFP est plus long que la mitose, des modèles dégradants de dents de scie d’intensité de fluorescence sont observés. Dans le modèle, nous avons supposé que la réplication du plasmide est assez rapide pour que la distribution plasmide reste constante avant et après la division. L’étiquette de dégradation ssrA réduit souvent le temps de demi-vie des protéines d’heures à moinsd’une heure 5 et conduit à un état stable rapide. Nous avons montré que la méthode fournit également une distribution similaire à celle mesurée avec un analyseur de flux de population élevé et que le CV de cette distribution est égal ou plus petit que le CV de l’analyseur de flux.
Alors que plusieursméthodes 3,7,18 ont été développées pour l’imagerie cellulaire vivante, la méthode présentée ici est spécifiquement adaptée à Escherichia coli. Cette bactérie nécessite un média spécial et une approche légèrement différente. Le protocole présente les caractéristiques importantes suivantes : (1) Établir un rapport de dilution spécifique aux bactéries et à la souche au début de la croissance exponentielle plutôt qu’au stade intermédiaire (croissance exponentielle sans trembler) (2) Escherichia coli se divise le mieux à 37 °C, mais à 37 °C, le gel média minimal perd rapidement de l’eau, ce qui entraîne un rétrécissement et une instabilité. Le protocole ici surmonte ce défi (3) Nous appliquons d’abord l’échantillon de bactéries, puis le sceller avec du gel liquide. Comme l’échantillon est coincé entre le fond de verre et le gel, nous avons besoin d’un gel qui (I) permet l’échange de gaz pour éviter de couper les poches d’air, (II) reste liquide à basse température car Escherichia coli est sensible à la chaleur et (III) s’assure que l’échantillon ne sera pas mélangé à l’intérieur du gel liquide. Le gel reste liquide à 37 °C, toutefois, nous recommandons l’utilisation d’un bouchon de protection sur le dessus de l’échantillon pour éviter la chaleur excessive et le mélange d’échantillons à l’intérieur du gel (4) Cette approche nécessite un équipement simple et générique (5) Les échantillons peuvent être mesurés directement sans préchauffage, de sorte qu’il n’y a pas de perte d’événements de division (6) Le protocole, qui comprend les étapes de laboratoire humide et le logiciel automatisé personnalisé, peut être utilisé pour étudier le comportement stochastique des circuits génétiques tels que la quantification du SNR et du CV des signaux de circuit. Nous avons comparé la méthode de microscopie pour couler les résultats de l’analyseur afin de valider l’utilisation de petites populations de cellules et d’établir une base de comparaison selon CV (7) Le logiciel nous permet de détecter les cellules sur le monocouche sans intervention humaine et d’analyser le bruit total. Les outils logiciels tels que ImageJ18 ou Schnitzcells nécessitent l’identification manuelle des cellules et sont difficiles pour les ajustements.
Lors de l’imagerie continue des colonies cellulaires vivantes, concevoir l’expérience tout en tenant compte de plusieurs paramètres physiques complexes, tels que le stress cellulaire et la toxicité, le taux d’épuisement des ressources, la nécrose et le temps de dégradation des inducteurs et des produits chimiques. Le protocole permet une mesure fiable jusqu’à cinq heures. Nos expériences suggèrent qu’Escherichia coli synchronise lors de la division en micro, colonies monocouches (Vidéo supplémentaire 3). Nous supposons que le gel est uniforme en termes de ressources et de robustesse, les cellules ont un comportement similaire, et le champ d’éclairage est légèrement plus grand du champ de vision. Ainsi, chaque cellule doit produire le même signal et les mêmes données statistiques, qui peuvent être recueillies comme nous l’avons montré en comparant le CV obtenu de cette façon à la mesure avec un analyseur de flux. Afin de mesurer le bruit à des conditions initiales constantes pendant de plus longues périodes de temps, nous envisagerons d’utiliser des puces microfluidiques à l’avenir. D’autres avantages d’un tel dispositif maintiennent des positions fixes des cellules et la mise au point stable10. Pourtant, la conception, la fabrication de puces microfluidiques et l’amorçage pour les expériences nécessitent une formation, un équipement spécifique (sur mesure parfois) et le temps. Pour cette raison, il est avantageux d’utiliser la microscopie time lapse comme le montre ce protocole pour acquérir une compréhension générale du circuit.
Le protocole proposé et le logiciel développé permettent des mesures reproductibles, à partir de laquelle il est simple de dériver des graphiques. Il permet également de tester et de comparer le bruit total et peut être modifié pour mesurer le bruit intrinsèque et extrinsèque. La méthode est basée sur des matériaux génériques ou faciles à commander, ouvertement partagés, faciles à utiliser et ne nécessite pas de formation spécifique. Nous avons montré que la population mesurée par microscopie est suffisamment grande pour obtenir des données significatives en comparant la méthode CV à celle obtenue avec un analyseur de flux. Par conséquent, nous pouvons établir avec succès une ligne de base SNR en utilisant ce protocole et le comparer à des circuits génétiques plus complexes.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions M. Gil Gelbert (Faculté de génie électrique, Technion) d’avoir aidé avec le code MATLAB. Nous remercions le Dr Ximing Li (Faculté de génie biomédical, Technion) d’avoir aidé à prouver cet article. Cette recherche a été partiellement soutenue par la Fondation de la famille Neubauer et le ministère israélien des Sciences, subvention 2027345.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35mm glass dish | mattek | P35G-0.170-14-C | thickness corresponding with microscope lense. |
| Agarose | Lonza | 5004 | LB preperation |
| AHL | Sigma-Aldrich | K3007 | inducer |
| Bacto tryptone | BD - Becton, Dickinson and Company | 211705 | LB preperation |
| Carb | Invitrogen | 10177-012 | antibiotic |
| Carb | Formedium | CAR0025 | antibiotic |
| Casamino acids | BD - Becton, Dickinson and Company | 223050 | minimal media solution |
| eclipse Ti | nikon | inverted microscope | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | minimal media solution |
| Glyserol | Bio-Lab | 000712050100 | minimal media substrate |
| Immersol 518F | zeiss | 4449600000000 | immersion oil |
| M9 salt solution | Sigma-Aldrich | M6030 | minimal media solution |
| NaCl | Bio-Lab | 214010 | LB preperation |
| Noble agar | Sigma-Aldrich | A5431 | minimal media substrate |
| parafilm tape | Bemis | PM-996 | refered to as tape in text |
| Seaplaque GTG Agarose | Lonza | 50111 | minimal media substrate |
| thaymine B1 | Sigma-Aldrich | T0376 | minimal media solution |
| Yeast Extract | BD - Becton, Dickinson and Company | 212750 | LB preperation |
References
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