التركيز المسبق المستند إلى الورق وعزلة الميكروفيسلات واكسوسوم
Summary
يتم تقديم بروتوكول لتصنيع جهاز ورقي لإثراء وعزل الميكروبات والكوسومات بشكل فعال.
Abstract
microvesicles وicssosomes هي الحويصلات membranous الصغيرة التي تم إصدارها إلى البيئة خارج الخلية وتعميمها في جميع أنحاء الجسم. ولأنها تحتوي على جزيئات بيولوجية مشتقة من خلايا أبوية مختلفة مثل الحمض النووي، والميرنا، والميرنا، والبروتينات، والدهون، فإن إغناءها وعزلها هما خطوتان حاسمتان لاستغلالهما كمعلمات بيولوجية محتملة للتطبيقات السريرية. ومع ذلك، فإن طرق العزل التقليدية (مثل الطرد الشديد) تسبب خسائر كبيرة وأضرار في الميكروسات الدقيقة. تتطلب هذه الطرق أيضًا خطوات متكررة متعددة للطرد الشديد التركيز والتحميل وإهدار الكواشف. توضح هذه المقالة طريقة مفصلة لاختلاق جهاز الورق اوريغامي القائم على (Exo-PAD) مصممة لإثراء فعالة وعزلة من microvesicles و exosomes بطريقة بسيطة. إن التصميم الفريد لـ Exo-PAD، الذي يتكون من طبقات متعددة الطبقات الشبيهة بالأكورديون مع مناطق عينة متقاربة، مدمج مع تقنية استقطاب تركيزات الأيونات، مما يتيح إثراء خمسة أضعاف من الطبقات الدقيقة والأكسوسوم على طبقات محددة. وبالإضافة إلى ذلك، يتم عزل microvesicles المخصب واكسوسوم ببساطة من خلال تتكشف إكسو-PAD.
Introduction
الدقيقة والويسوس هي غشاء صغير الحويصلات قياس 0.2−1 ميكرومتر و 30-200 نانومتر، على التوالي. ويفرز في بيئة خارج الخلية من قبل عدة أنواع مختلفة من الخلايا1،2،3،4،5. أنها تحتوي على معلومات الخلية الأبوية في شكل مجموعات فرعية من الحمض النووي، مرنا، ميرنا، البروتينات، والدهون، وتدور في جميع أنحاء الجسم عن طريق سوائل الجسم المختلفة مثل المصل، والبلازما، والبول، والسوائل النخاعية، السائل الأمنيوسي، واللعاب6،,7،,8،,9. وهكذا، يمكن أن توفر تقنيات العزل الفعال للميكروسات الدقيقة والإكسوسومات من السوائل البيولوجية فرصًا واسعة في مجالات التشخيص والتكهن والرصد في الوقت الفعلي للمرض، وكذلك في تطوير علاجات جديدة.
ومع ذلك، فإن طريقة العزل التقليدية للميكروسينتوريس و الكوسومات القائمة على الطرد فوق المركز تستغرق وقتاً طويلاً للغاية وتسبب خسارة كبيرة وتلوث العينة. وذلك لأنه ينطوي على عدة خطوات مرهقة pipetting والتحميل والتخلص من الكواشف المختلفة مع تكرار الrifugation5،6،10،11،12. وعلاوة على ذلك، يمكن أن يسبب الإجهاد القص عالية الناجمة عن الطاردة المفرطة (~ 100،000 س ز) التحلل المادي من microvesicles واكسوزومات، مما يؤدي إلى معدلات انتعاش الفقراء (5-23٪)6،,13،,14. ولذلك، يجب تطوير تقنية عزل عالية الكفاءة وغير مزعجة للميكروفيسيليس واكسوسومات للحد من الأضرار والفقدان، وبالتالي تحقيق معدلات أعلى للتعافي.
تم تطوير جهاز اوريغامي ورقة المستندة (Exo-PAD) لعزل أبسط وألطف، وكفاءة عالية من microvesicles و exosomes6. تصميم EXO-PAD هو ورقة متعددة المستويات مع مناطق عينة متصلة بشكل تسلسلي التي تتناقص تدريجيا في القطر. تم دمج تقنية استقطاب تركيز الأيوني (ICP) ، وهي ظاهرة نانو كهربية مركزية تعمل قبل التركيز على الجزيئات الحيوية المشحونة ، مع هذا التصميم الفريد. أدى استخدام EXO-PAD إلى إثراء خمسة أضعاف من microvesicles وicsos في طبقات محددة وعزلها ببساطة عن طريق الكشف عن الجهاز. توضح هذه المقالة EXO-PAD بالتفصيل، من التصنيع العام للجهاز وتشغيله إلى تحليل استخدامه، لتوضيح الأسلوب وإظهار النتائج التمثيلية6.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن EXO-PAD استخدمت بنجاح لإثراء وعزل microvesicles وicsos، ينبغي النظر بعناية عدة نقاط حرجة: 1) وقت حضانة الفرن ودرجة الحرارة أثناء إعداد الجهاز، 2) وقت المعالجة، 3) تطبيق الجهد مع أرقام طبقة متفاوتة وأقطار منطقة العينة، و 4) إمكانية التطبيق على العينات السريرية.
وقت الحضانة و?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعمت هذه الدراسة من قبل المؤسسة الوطنية للبحوث في كوريا، منحة NRF-2018R1D1A1A090840444. تم دعم J. H. Lee بمنحة بحثية من جامعة كوانجون في عام 2019. 11- وقد تلقى هيرين كيم الدعم من “برنامج تطوير الكفاءة للمتخصصين في الصناعة” التابع لوزارة التجارة والصناعة والطاقة الكورية، الذي يديره المعهد الكوري للنهوض بالتكنولوجيا (KIAT) (رقم 1999). P0002397، HRD برنامج التقارب الصناعي للأجهزة الذكية القابلة للارتداء).
Materials
| Ag/AgCl electrodes | A-M Systems, Inc. | 531500 | 0.15" diameter |
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm) |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Carbonate buffer |
| CorelDraw software (Coral Co., Canada) | Corel Corporation | Printer software to define wax printing region | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Wax printer | |
| Chromatography paper grade 1 | Whatman | 3001-861 | Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm |
| Fluorescent-labeled exosome standards | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm) |
| Keithley 2410 current/voltage source-meter | Keithley Instruments, Inc. | Current–voltage source measurement system | |
| Nafion perfluorinated resin solution | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water |
| NanoSight LM10 | NanoSight Technology | Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
References
- Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
- Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes – vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).
- Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).
- Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).
- Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
- Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).
- Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).
- Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
- Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18 (10), 3175 (2018).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).
- Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).
