Préconcentration et isolation des microvesicules et des exosomes sur papier
Summary
Présenté est un protocole pour fabriquer un dispositif à base de papier pour l’enrichissement et l’isolement efficaces des microvesicules et des exosomes.
Abstract
Les microvesicules et les exosomes sont de petites vésicules membraneuses libérées dans l’environnement extracellulaire et distribuées dans tout le corps. Étant donné qu’ils contiennent diverses biomolécules d’origine cellulaire parentale telles que l’ADN, l’ARNm, le miARN, les protéines et les lipides, leur enrichissement et leur isolement sont des étapes essentielles pour leur exploitation en tant que biomarqueurs potentiels pour les applications cliniques. Toutefois, les méthodes d’isolement conventionnelles (p. ex., l’ultracentrifugation) causent des pertes et des dommages importants aux microvesicules et aux exosomes. Ces méthodes nécessitent également de multiples étapes répétitives d’ultracentrifugation, de chargement et de gaspillage de réactifs. Cet article décrit une méthode détaillée pour fabriquer un dispositif à base de papier origami (Exo-PAD) conçu pour l’enrichissement et l’isolement efficaces des microvesicules et des exosomes d’une manière simple. La conception unique de l’Exo-PAD, composée de couches multiples en forme d’accordéon avec des zones d’échantillonnage convergentes, est intégrée à la technique de polarisation de la concentration des ions, permettant ainsi un enrichissement quintuple des microvesicules et des exosomes sur des couches spécifiques. En outre, les microvesicules enrichies et les exosomes sont isolés en déployant simplement l’Exo-PAD.
Introduction
Les microvesicules et les exosomes sont de petites vésicules membranaires mesurant respectivement 0,2−1 μm et 30−200 nm. Ils sont sécrétés dans l’environnement extracellulaire par plusieurs types de cellules différents1,2,3,4,5. Ils contiennent des informations relatives aux cellules parentales sous forme de sous-ensembles d’ADN, d’ARNm, de miARN, de protéines et de lipides, et circulent dans tout le corps via divers fluides corporels tels que le sérum, le plasma, l’urine, le liquide céphalo-rachidien, le liquide amniotique et la salive6,,7,8,9. Ainsi, les techniques d’isolement efficace des microvesicules et des exosomes des fluides biologiques peuvent fournir de vastes possibilités dans les domaines du diagnostic, du pronostic et de la surveillance en temps réel de la maladie, ainsi que dans le développement de nouvelles thérapies.
Cependant, la méthode d’isolement conventionnelle pour les microvesicules et les exosomes basée sur l’ultracentrifugation prend énormément de temps et entraîne une perte et une contamination importantes de l’échantillon. C’est parce qu’il implique plusieurs étapes lourdes de pipetage et de chargement et le rejet de divers réactifs avec ultracentrifugation répétée5,6,10,11,12. En outre, le stress de cisaillement élevé induit par l’ultracentrifugation (~100 000 x g)peut causer la lyse physique des microvesicules et des exosomes, ce qui donne de faibles taux de récupération (5−23%)6,13,14. Par conséquent, une technique d’isolement discrète et très efficace pour les microvesicules et les exosomes doit être développée pour réduire les dommages et les pertes, atteignant ainsi des taux de récupération plus élevés.
Un dispositif origami-papier (Exo-PAD) a été développé pour un isolement plus simple, plus doux et très efficace des microvesicules et des exosomes6. La conception de l’Exo-PAD est un papier multifréqué avec des zones d’échantillonnage reliées en série qui diminuent progressivement de diamètre. La technique de polarisation de la concentration des ions (ICP), qui est un phénomène nano-électrocinétique qui préconcentre les biomolécules chargées par les préconcentrés, a été intégrée à cette conception unique. L’utilisation de l’Exo-PAD a entraîné un enrichissement quintuple des microvesicules et des exosomes dans des couches spécifiques et leur isolement en déroulant simplement l’appareil. Cet article décrit l’Exo-PAD en détail, de la fabrication et de l’exploitation globales de l’appareil à l’analyse de son utilisation, pour illustrer la méthode et afficher des résultats représentatifs6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bien que l’Exo-PAD ait été utilisé avec succès pour l’enrichissement et l’isolement des microvesicules et des exosomes, plusieurs points critiques doivent être soigneusement examinés : 1) le temps et la température d’incubation du four pendant la préparation de l’appareil, 2) le temps de traitement, 3) l’application de la tension avec des nombres de couches variables et les diamètres de la surface d’échantillonnage, et 4) l’applicabilité aux échantillons cliniques.
…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par la National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee a reçu le soutien d’une subvention de recherche de l’Université Kwangwoon en 2019. Hyerin Kim a reçu l’appui du « Programme de développement des compétences pour les spécialistes de l’industrie » du Ministère coréen du commerce, de l’industrie et de l’énergie (MOTIE), géré par le Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (No. P0002397, programme drh pour la convergence industrielle des appareils intelligents portables).
Materials
| Ag/AgCl electrodes | A-M Systems, Inc. | 531500 | 0.15" diameter |
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm) |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Carbonate buffer |
| CorelDraw software (Coral Co., Canada) | Corel Corporation | Printer software to define wax printing region | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Wax printer | |
| Chromatography paper grade 1 | Whatman | 3001-861 | Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm |
| Fluorescent-labeled exosome standards | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm) |
| Keithley 2410 current/voltage source-meter | Keithley Instruments, Inc. | Current–voltage source measurement system | |
| Nafion perfluorinated resin solution | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water |
| NanoSight LM10 | NanoSight Technology | Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
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