पेपर-आधारित प्रीकंसेंट्रेशन और माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स का अलगाव
Summary
प्रस्तुत किया गया एक प्रोटोकॉल है जो माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के प्रभावी संवर्धन और अलगाव के लिए एक कागज आधारित उपकरण बनाने के लिए है।
Abstract
माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स छोटे झिल्लीदार वेसिकल्स हैं जो बाहुलर वातावरण में जारी किए जाते हैं और पूरे शरीर में परिचालित होते हैं। क्योंकि उनमें डीएनए, एमआरएनए, मिरना, प्रोटीन और लिपिड जैसे विभिन्न पैतृक कोशिका-व्युत्पन्न जैव अणु होते हैं, उनके संवर्धन और अलगाव नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए संभावित बायोमार्कर के रूप में उनके शोषण के लिए महत्वपूर्ण कदम हैं। हालांकि, पारंपरिक अलगाव विधियों (जैसे, अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन) से माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को महत्वपूर्ण नुकसान और नुकसान होता है। इन तरीकों के लिए अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन, लोडिंग और रिएजेंट्स को बर्बाद करने के कई दोहराव वाले कदमों की भी आवश्यकता होती है। यह लेख एक विस्तृत विधि का वर्णन करता है जो एक ओरिगेमी-पेपर-आधारित डिवाइस (एक्सो-पैड) को सरल तरीके से माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के प्रभावी संवर्धन और अलगाव के लिए डिज़ाइन किया गया है। एक्सो-पैड का अनूठा डिजाइन, जिसमें अभिसरण नमूना क्षेत्रों के साथ अकॉर्डियन जैसी बहुमुल्ड परतें शामिल हैं, आयन एकाग्रता ध्रुवीकरण तकनीक के साथ एकीकृत है, जिससे विशिष्ट परतों पर माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के पांच गुना संवर्धन को सक्षम किया जाता है। इसके अलावा, समृद्ध माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स को बस एक्सो-पैड का खुलासा करके अलग-थलग कर दिया जाता है।
Introduction
माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम क्रमशः 0.2−1 माइक्रोन और 30−200 एनएम मापने वाले छोटे झिल्ली वेसिकल्स हैं। इन्हें कई अलग – अलग – अलग सेल प्रकार 1,,2, 3 ,4,,,5से बाहुलकर वातावरण में स्रावित कियाजाताहै .5 इनमें डीएनए, एमआरएनए, मिरना, प्रोटीन और लिपिड के सबसेट के रूप में माता-पिता की कोशिका जानकारी होती है, और सीरम, प्लाज्मा, मूत्र, सेरेब्रोस्पाइनल तरल पदार्थ, एमनियोटिक द्रव, और,लार6,7,8,9जैसे शरीर के विभिन्न तरल पदार्थों के माध्यम से पूरे शरीर में प्रसारित होती है।,, इस प्रकार, जैविक तरल पदार्थों से माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के कुशल अलगाव की तकनीक निदान, पूर्वानुमान और रोग की वास्तविक समय की निगरानी के साथ-साथ नए चिकित्सीय के विकास में व्यापक अवसर प्रदान कर सकती है।
हालांकि, अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन के आधार पर माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के लिए पारंपरिक अलगाव विधि बेहद समय लेने वाली है और नमूने के महत्वपूर्ण नुकसान और संदूषण का कारण बनती है। इसका कारण यह है कि इसमें कई बोझिल पाइपिंग और लोडिंग कदम शामिल हैं और विभिन्न अभिकर्णों को बार – बार अल्ट्रासेंट्रफ्यूजेशन 5 ,6,10,,11,,12से त्यागना शामिल है ।11 इसके अलावा, अल्ट्रासेंट्रफ्यूगेशन (~ 100,000 x g)द्वारा प्रेरित उच्च कतरनी तनाव माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स की शारीरिक रूप से लाइसिस का कारण बन सकता है, जिससे खराब वसूली दर (5−23%)6,13,,14हो सकती है।, इसलिए, क्षति और हानि को कम करने के लिए माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के लिए एक अत्यधिक कुशल, विनीत अलगाव तकनीक विकसित की जानी चाहिए, जिससे उच्च वसूली दर प्राप्त हो सके।
एक ओरिगामी-पेपर-आधारित डिवाइस (एक्सो-पैड) को माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स6के सरल, जेंटलर और अत्यधिक कुशल अलगाव के लिए विकसित किया गया था। एक्सो-पैड का डिजाइन धारावाहिक रूप से जुड़े नमूना क्षेत्रों के साथ एक बहुगुना कागज है जो धीरे-धीरे व्यास में कम होता है। आयन एकाग्रता ध्रुवीकरण (आईसीपी) तकनीक, जो एक नैनो-इलेक्ट्रोकाइनेटिक घटना है जो बायोमॉलिक्यूल्स का आरोप लगाने वाली पूर्वसंकेंद्रित है, इस अनूठे डिजाइन के साथ एकीकृत किया गया था। Exo-PAD का उपयोग करने के परिणामस्वरूप विशिष्ट परतों में माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स का पांच गुना संवर्धन हुआ और बस डिवाइस का खुलासा करके उनके अलगाव । यह लेख एक्सो-पैड का विस्तार से वर्णन करता है, समग्र डिवाइस निर्माण और संचालन से लेकर इसके उपयोग के विश्लेषण तक, विधि को समझाने और प्रतिनिधि परिणाम6दिखाने के लिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
यद्यपि एक्सो-पैड का उपयोग माइक्रोवेसिकल्स और एक्सोसोम्स के संवर्धन और अलगाव के लिए सफलतापूर्वक किया गया था, कई महत्वपूर्ण बिंदुओं पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए: 1) डिवाइस तैयार करने के दौरान …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को कोरिया के नेशनल रिसर्च फाउंडेशन, ग्रांट एनआरएफ-2018R1D1A1A09084044 द्वारा समर्थित किया गया था। जे एच ली को 2019 में क्वांगवॉन विश्वविद्यालय के एक शोध अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। Hyerin किम व्यापार, उद्योग और ऊर्जा मंत्रालय (MOTIE), कोरिया प्रौद्योगिकी संस्थान (KIAT) (नहीं) द्वारा संचालित के “उद्योग विशेषज्ञों के लिए योग्यता विकास कार्यक्रम” द्वारा समर्थित किया गया था । P0002397, वियरेबल स्मार्ट उपकरणों के औद्योगिक अभिसरण के लिए एचआरडी कार्यक्रम)।
Materials
| Ag/AgCl electrodes | A-M Systems, Inc. | 531500 | 0.15" diameter |
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm) |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Carbonate buffer |
| CorelDraw software (Coral Co., Canada) | Corel Corporation | Printer software to define wax printing region | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Wax printer | |
| Chromatography paper grade 1 | Whatman | 3001-861 | Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm |
| Fluorescent-labeled exosome standards | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm) |
| Keithley 2410 current/voltage source-meter | Keithley Instruments, Inc. | Current–voltage source measurement system | |
| Nafion perfluorinated resin solution | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water |
| NanoSight LM10 | NanoSight Technology | Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
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