Papirbasert preconcentration og isolering av mikrovesicles og exosomer
Summary
Presentert er en protokoll for å fremstille en papirbasert enhet for effektiv berikelse og isolering av mikroveskler og eksosomer.
Abstract
Mikrokjøretøy og eksosomer er små membranøse vesikler som frigjøres til det ekstracellulære miljøet og sirkuleres i hele kroppen. Fordi de inneholder ulike foreldrecelleavledede biomolekyler som DNA, mRNA, miRNA, proteiner og lipider, er deres berikelse og isolasjon kritiske skritt for deres utnyttelse som potensielle biomarkører for kliniske applikasjoner. Konvensjonelle isolasjonsmetoder (f.eks. ultracentrifugation) forårsaker imidlertid betydelig tap og skade på mikroveskler og eksosomer. Disse metodene krever også flere repeterende trinn av ultracentrifugation, lasting, og sløse av reagenser. Denne artikkelen beskriver en detaljert metode for å fremstille en origami-papirbasert enhet (Exo-PAD) designet for effektiv berikelse og isolering av mikroveskler og eksosomer på en enkel måte. Den unike utformingen av Exo-PAD, som består av trekkspilllignende flerfoldede lag med konvergerende prøveområder, er integrert med ionkonsentrasjonspolariseringsteknikken, og muliggjør dermed femdoblet berikelse av mikrovesiklene og eksosomene på bestemte lag. I tillegg isoleres de berikede mikrovesiklene og eksosomene ved ganske enkelt å utfolde Exo-PAD.
Introduction
Mikrokjøretøy og eksosomer er små membran vesikler som måler henholdsvis 0,2-1 μm og 30-200 nm. De utskilles i det ekstracellulære miljøet av flere forskjellige celletyper1,,2,,3,,4,5. De inneholder foreldrecelleinformasjon i form av undergrupper av DNA, mRNA, miRNA, proteiner og lipider, og sirkulerer i hele kroppen via ulike kroppsvæsker som serum, plasma, urin, cerebrospinalvæske, fostervann og spytt6,7,8,9. Dermed kan teknikker for effektiv isolering av mikrovesikler og eksosomer fra biologiske væsker gi omfattende muligheter innen diagnose, prognose og sanntidsovervåking av sykdom, samt i utviklingen av nye terapeutiske midler.
Den konvensjonelle isolasjonsmetoden for mikroveskler og eksosomer basert på ultracentrifugering er imidlertid ekstremt tidkrevende og forårsaker betydelig tap og forurensning av prøven. Dette er fordi det innebærer flere tungvint pipettering og lasting trinn og kassering av ulike reagenser med gjentatt ultracentrifugation5,6,10,11,12. Videre kan det høye skjærstresset forårsaket av ultracentrifugation (~ 100.000 x g)forårsake fysisk lysis av mikroveskler og eksosomer, noe som gir dårlig utvinning (5-23%)6,13,14. Derfor må en svært effektiv, diskret isolasjonsteknikk for mikroveskler og eksosomer utvikles for å redusere skade og tap, og dermed oppnå høyere utvinningsgrad.
En origami-papirbasert enhet (Exo-PAD) ble utviklet for enklere, mildere og svært effektiv isolering av mikroveskler og eksosomer6. Utformingen av Exo-PAD er et papir med flerefold med seriellede prøveområder som gradvis reduseres i diameter. Ionkonsentrasjonspolariseringsteknikken (ICP), som er et nanoelektrokinetisk fenomen som prekonstruerer ladede biomolekyler, ble integrert med denne unike designen. Bruk av Exo-PAD resulterte i femdoble berikelse av mikrovesiklene og eksosomene i bestemte lag og deres isolasjon ved ganske enkelt å utfolde enheten. Denne artikkelen beskriver Exo-PAD i detalj, fra den generelle enheten fabrikasjon og drift til analyse av bruken, for å illustrere metoden og vise representative resultater6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om Exo-PAD ble brukt med hell for berikelse og isolering av mikroveskler og eksosomer, bør flere kritiske punkter vurderes nøye: 1) ovnsinkubasjonstiden og temperaturen under fremstillingen av enheten, 2) behandlingstid, 3) påføring av spenning med varierende lagtall og prøveområdediametere, og 4) anvendelighet til kliniske prøver.
Inkubasjonstiden og temperaturen som er gitt i protokollen er optimaliserte forhold for å fremstille en pålitelig enhet. Lengre inkubasjonstider eller…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee ble støttet av et forskningsstipend fra Kwangwoon University i 2019. Hyerin Kim ble støttet av “Competency Development Program for Industry Specialists” av det koreanske handels-, industri- og energidepartementet (MOTIE), drevet av Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (Nr. P0002397, HRD-program for industriell konvergens av bærbare smarte enheter).
Materials
| Ag/AgCl electrodes | A-M Systems, Inc. | 531500 | 0.15" diameter |
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm) |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Carbonate buffer |
| CorelDraw software (Coral Co., Canada) | Corel Corporation | Printer software to define wax printing region | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Wax printer | |
| Chromatography paper grade 1 | Whatman | 3001-861 | Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm |
| Fluorescent-labeled exosome standards | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm) |
| Keithley 2410 current/voltage source-meter | Keithley Instruments, Inc. | Current–voltage source measurement system | |
| Nafion perfluorinated resin solution | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water |
| NanoSight LM10 | NanoSight Technology | Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
References
- Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
- Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes – vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).
- Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).
- Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).
- Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
- Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).
- Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).
- Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
- Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18 (10), 3175 (2018).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).
- Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).
