Preconcentración basada en papel y aislamiento de microvesículas y exosomas
Summary
Presentado es un protocolo para fabricar un dispositivo basado en papel para el enriquecimiento y aislamiento efectivos de microvesículas y exosomas.
Abstract
Las microvesículas y exosomas son pequeñas vesículas membranosas liberadas al ambiente extracelular y circulan por todo el cuerpo. Debido a que contienen varias biomoléculas derivadas de células parentales como ADN, ARNm, miRNA, proteínas y lípidos, su enriquecimiento y aislamiento son pasos críticos para su explotación como biomarcadores potenciales para aplicaciones clínicas. Sin embargo, los métodos de aislamiento convencionales (por ejemplo, ultracentrifugación) causan pérdidas significativas y daños a microvesículas y exosomas. Estos métodos también requieren múltiples pasos repetitivos de ultracentrifugación, carga y desgaste de reactivos. Este artículo describe un método detallado para fabricar un dispositivo basado en papel de origami (Exo-PAD) diseñado para el enriquecimiento y aislamiento efectivos de microvesículas y exosomas de una manera sencilla. El diseño único del Exo-PAD, que consiste en capas multidobladas similares al acordeón con áreas de muestra convergentes, se integra con la técnica de polarización de concentración de iones, lo que permite un enriquecimiento quintuplicado de las microvesículas y exosomas en capas específicas. Además, las microvesículas y exosomas enriquecidos se aíslan simplemente desplegando el Exo-PAD.
Introduction
Las microvesículas y los exosomas son vesículas de membrana pequeñas que miden 0,2 a 1 m y 30 a 200 nm, respectivamente. Son secretados en el entorno extracelular por varios tipos de células diferentes1,2,3,4,5. Contienen información de células parentales en forma de subconjuntos de ADN, ARNm, MIRNA, proteínas y lípidos, y circulan por todo el cuerpo a través de diversos fluidos corporales como suero, plasma, orina, líquido cefalorraquídeo, líquido amniótico y saliva6,7,8,9. Por lo tanto, las técnicas para el aislamiento eficiente de microvesículas y exosomas de fluidos biológicos pueden proporcionar amplias oportunidades en los campos del diagnóstico, pronóstico y monitoreo en tiempo real de la enfermedad, así como en el desarrollo de nuevas terapias.
Sin embargo, el método de aislamiento convencional para microvesículas y exosomas basados en la ultracentrifugación consume mucho tiempo y causa una pérdida y contaminación significativas de la muestra. Esto se debe a que implica varios pasos de pipeteo y carga engorrosos y el descarte de varios reactivos con ultracentrifugación repetida5,6,10,11,12. Por otra parte, la alta tensión de cizallamiento inducida por la ultracentrifugación (100.000 x g)puede causar la lysis física de microvesículas y exosomas, produciendo tasas de recuperación deficientes (5-23%)6,,13,,14. Por lo tanto, se debe desarrollar una técnica de aislamiento altamente eficiente y discreta para microvesículas y exosomas para reducir el daño y la pérdida, logrando así mayores tasas de recuperación.
Un dispositivo basado en papel de origami (Exo-PAD) fue desarrollado para un aislamiento más simple, suave y altamente eficiente de microvesículas y exosomas6. El diseño del Exo-PAD es un papel multiplicizado con áreas de muestra conectadas en serie que disminuyen gradualmente de diámetro. La técnica de polarización de la concentración de iones (ICP), que es un fenómeno nanoelectrocinético que preconcentra biomoléculas cargadas, se integró con este diseño único. El uso del Exo-PAD dio como resultado un enriquecimiento quintuplicado de las microvesículas y exosomas en capas específicas y su aislamiento simplemente desplegando el dispositivo. Este artículo describe el Exo-PAD en detalle, desde la fabricación y operación general del dispositivo hasta el análisis de su uso, para ilustrar el método y mostrar resultados representativos6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aunque el Exo-PAD se utilizó con éxito para el enriquecimiento y aislamiento de microvesículas y exosomas, se deben considerar cuidadosamente varios puntos críticos: 1) el tiempo y la temperatura de incubación del horno durante la preparación del dispositivo, 2) el tiempo de procesamiento, 3) la aplicación de voltaje con diferentes números de capa y diámetros de área de muestra, y 4) la aplicabilidad a las muestras clínicas.
El tiempo de incubación y la temperatura indicados en el …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por la National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A090840444. J. H. Lee fue apoyado por una beca de investigación de la Universidad de Kwangwoon en 2019. Hyerin Kim recibió el apoyo del “Programa de Desarrollo de Competencias para Especialistas en Industria” del Ministerio de Comercio, Industria y Energía de Corea (MOTIE), operado por el Instituto Coreano para el Avance de la Tecnología (KIAT) (No. P0002397, programa HRD para la convergencia industrial de dispositivos inteligentes portátiles).
Materials
| Ag/AgCl electrodes | A-M Systems, Inc. | 531500 | 0.15" diameter |
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm) |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Carbonate buffer |
| CorelDraw software (Coral Co., Canada) | Corel Corporation | Printer software to define wax printing region | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Wax printer | |
| Chromatography paper grade 1 | Whatman | 3001-861 | Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm |
| Fluorescent-labeled exosome standards | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm) |
| Keithley 2410 current/voltage source-meter | Keithley Instruments, Inc. | Current–voltage source measurement system | |
| Nafion perfluorinated resin solution | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water |
| NanoSight LM10 | NanoSight Technology | Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
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