Pappersbaserad förkoncentration och isolering av mikrovesiklar och exosomer
Summary
Presenteras är ett protokoll för att tillverka en pappersbaserad enhet för effektiv anrikning och isolering av mikrovesicles och exosomer.
Abstract
Microvesicles och exosomer är små membranösa blåsor släpps till den extracellulära miljön och cirkulerade i hela kroppen. Eftersom de innehåller olika föräldracell-härledda biomolekyler såsom DNA, mRNA, miRNA, proteiner och lipider, deras anrikning och isolering är avgörande steg för deras utnyttjande som potentiella biomarkörer för kliniska tillämpningar. Konventionella isoleringsmetoder (t.ex. ultracentrifugering) orsakar dock betydande förlust och skador på mikrovesicles och exosomer. Dessa metoder kräver också flera repetitiva steg av ultracentrifugering, lastning och slöseri med reagenser. I den här artikeln beskrivs en detaljerad metod för att tillverka en origami-pappersbaserad enhet (Exo-PAD) avsedd för effektiv anrikning och isolering av mikrovesiklar och exosomer på ett enkelt sätt. Exo-PAD:s unika design, som består av dragspelsliknande multifolded-lager med konvergenta provområden, är integrerad med jonkoncentrationspolariseringstekniken, vilket möjliggör femdubbling av mikrovesiklarna och exosomer på specifika lager. Dessutom är de berikade mikrovesicles och exosomer isolerade genom att helt enkelt veckla ut Exo-PAD.
Introduction
Mikrovesiklar och exosomer är små membranblåsor som mäter 0,2−1 μm respektive 30−200 nm. De utsöndras i den extracellulära miljön med flera olika celltyper1,,2,,3,,4,5. De innehåller föräldrarnas cellinformation i form av delmängder av DNA, mRNA, miRNA, proteiner och lipider, och cirkulerar i hela kroppen via olika kroppsvätskor såsom serum, plasma, urin, ryggmärgsvätska, fostervatten och saliv6,,7,,8,9. Således kan tekniker för effektiv isolering av mikrovessicles och exosomer från biologiska vätskor ge omfattande möjligheter inom områdena diagnos, prognos och realtidsövervakning av sjukdomar, samt i utvecklingen av nya terapier.
Den konventionella isoleringsmetoden för mikrovessicles och exosomer baserade på ultracentrifugering är dock extremt tidskrävande och orsakar betydande förlust och kontaminering av provet. Detta beror på att det innebär flera besvärliga pipettering och lastning steg och kasta olika reagenser med upprepade ultracentrifugering5,6,10,11,12. Dessutom kan den höga skjuvspänning som orsakas av ultracentrifugering (~100 000 x g) orsaka fysisk lys av mikrovessicles och exosomer, vilket ger dålig återhämtning (5−23%)6,13,14. Därför måste en mycket effektiv, diskret isoleringsteknik för mikrovesicles och exosomer utvecklas för att minska skador och förluster, vilket uppnår högre återvinningsgrad.
En origami-papper-baserad enhet (Exo-PAD) har utvecklats för enklare, mildare och mycket effektiv isolering av mikrovesiklar och exosomer6. Exo-PAD är ett flerfaldigt papper med seriekopplade provområden som gradvis minskar i diameter. Jonkoncentrationspolariseringstekniken (ICP), som är ett nanoelektroniskt fenomen som prekoncentrerar laddade biomolekyler, integrerades med denna unika design. Med hjälp av Exo-PAD resulterade i femfaldig anrikning av mikrovesiklar och exosomer i specifika lager och deras isolering genom att helt enkelt fälla ut enheten. I den här artikeln beskrivs Exo-PAD i detalj, från den övergripande enheten tillverkning och drift till analys av dess användning, för att illustrera metoden och visa representativa resultat6.
Protocol
Representative Results
Discussion
Även om Exo-PAD användes framgångsrikt för anrikning och isolering av mikrovessicles och exosomer, bör flera kritiska punkter noga övervägas: 1) ugnen inkubationstid och temperatur under enheten beredning, 2) bearbetningstid, 3) tillämpning av spänning med varierande skikt nummer och prov områdesdiametrar, och 4) tillämplighet på kliniska prover.
Inkubationstiden och temperaturen som anges i protokollet är optimerade förhållanden för att tillverka en tillförlitlig enhet. Läng…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna studie stöddes av National Research Foundation of Korea, Grant NRF-2018R1D1A1A09084044. J. H. Lee fick stöd av ett forskningsanslag från Kwangwoon University 2019. Hyerin Kim stöddes av “Kompetensutvecklingsprogrammet för industrispecialister” vid det koreanska ministeriet för handel, industri och energi (MOTIE), som drivs av Korea Institute for Advancement of Technology (KIAT) (Nr. P0002397, HRD-program för industriell konvergens av bärbara smarta enheter).
Materials
| Ag/AgCl electrodes | A-M Systems, Inc. | 531500 | 0.15" diameter |
| Albumin from Bovine Serum (BSA), Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13101 | BSA conjugated with Alexa Fluor 594 (Ex/Em: 590/617 nm) |
| Carbonate-Bicarbonate Buffer | Sigma-Aldrich | C3041-50CAP | Carbonate buffer |
| CorelDraw software (Coral Co., Canada) | Corel Corporation | Printer software to define wax printing region | |
| ColorQube 8870 | Xerox Corporation | Wax printer | |
| Chromatography paper grade 1 | Whatman | 3001-861 | Cellulose paper, dimension: 20 * 20 cm |
| Fluorescent-labeled exosome standards | HansaBioMed Life Sciences, Ltd. | HBM-F-PEP-100 | Exosome labeled with FITC (Ex/Em: 490/520 nm) |
| Keithley 2410 current/voltage source-meter | Keithley Instruments, Inc. | Current–voltage source measurement system | |
| Nafion perfluorinated resin solution | Sigma-Aldrich | 31175-20-9 | Permselective membrane, 20 wt.% in the mixture of lower aliphatic alcohols and water; contains 34% water |
| NanoSight LM10 | NanoSight Technology | Nanoparticle tracking analysis (NTA) machine | |
| Phosphate-buffered saline (PBS, pH7.4) | Thermo Fisher Scientific | 10010001 |
References
- Edgar, J. R. Q & A: What are exosomes, exactly. BMC Biology. 14 (1), 1-7 (2016).
- Contreras-Naranjo, J. C., Wu, H. J., Ugaz, V. M. Microfluidics for exosome isolation and analysis: Enabling liquid biopsy for personalized medicine. Lab on a Chip. 17 (21), 3558-3577 (2017).
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes – vesicular carriers for intercellular communication. Current Opinion in Cell Biology. 21 (4), 575-581 (2009).
- Ståhl, A. L., Johansson, K., Mossberg, M., Kahn, R., Karpman, D. Exosomes and microvesicles in normal physiology, pathophysiology, and renal diseases. Pediatric Nephrology. 34 (1), 11-30 (2019).
- Chen, C., Lin, B. R., Hsu, M. Y., Cheng, C. M. Paper-based devices for isolation and characterization of extracellular vesicles. Journal of Visualized Experiments. (98), e52722 (2015).
- Kim, H., et al. Origami-paper-based device for microvesicle/exosome preconcentration and isolation. Lab on a Chip. 19 (23), 3917-3921 (2019).
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Lee, Y., El Andaloussi, S., Wood, M. J. A. Exosomes and microvesicles: Extracellular vesicles for genetic information transfer and gene therapy. Human Molecular Genetics. 21, 125-134 (2012).
- Liu, C., et al. Field-Free Isolation of Exosomes from Extracellular Vesicles by Microfluidic Viscoelastic Flows. ACS Nano. 11 (7), 6968-6976 (2017).
- Marczak, S., et al. Simultaneous isolation and preconcentration of exosomes by ion concentration polarization. Electrophoresis. 39 (15), 2029-2038 (2018).
- Livshts, M. A., et al. Isolation of exosomes by differential centrifugation: Theoretical analysis of a commonly used protocol. Scientific Reports. 5, 1-14 (2015).
- Chiriacò, M. S., et al. Lab-on-chip for exosomes and microvesicles detection and characterization. Sensors. 18 (10), 3175 (2018).
- Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4 (1), 1-11 (2015).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Han, S., et al. Electrokinetic size-based spatial separation of micro/nanospheres using paper-based 3d origami preconcentrator. Analytical Chemistry. 91 (16), 10744-10749 (2019).
- Yeh, S. H., Chou, K. H., Yang, R. J. Sample pre-concentration with high enrichment factors at a fixed location in paper-based microfluidic devices. Lab on a Chip. 16 (5), 925-931 (2016).
