Toepassing van lasermicrodissectie om regionale transcriptomics in menselijk nierweefsel te ontdekken
Summary
We beschrijven een protocol voor lasermicrodissectie van subsegmenten van de menselijke nier, waaronder de glomerulus, proximale tubulus, dikke opgaande ledemaat, het verzamelen van kanaal en interstitium. Het RNA wordt vervolgens geïsoleerd uit de verkregen compartimenten en RNA-sequencing wordt uitgevoerd om wijzigingen in de transcriptomische handtekening binnen elk subsegment te bepalen.
Abstract
Genexpressieanalyse van menselijk nierweefsel is een belangrijk hulpmiddel om homeostase en ziektepathofysiologie te begrijpen. Het verhogen van de resolutie en diepte van deze technologie en het uitbreiden ervan tot het niveau van cellen in het weefsel is nodig. Hoewel het gebruik van single nuclear en single cell RNA sequencing wijdverspreid is geworden, behouden de expressiehandtekeningen van cellen verkregen uit weefseldissociatie geen ruimtelijke context. Lasermicrodissectie (LMD) op basis van specifieke fluorescerende markers zou de isolatie van specifieke structuren en celgroepen van belang met bekende lokalisatie mogelijk maken, waardoor ruimtelijk verankerde transcriptomische handtekeningen in nierweefsel kunnen worden verwerving. We hebben een LMD-methodologie geoptimaliseerd, geleid door een op fluorescentie gebaseerde vlek, om vijf verschillende compartimenten in de menselijke nier te isoleren en daaropvolgende RNA-sequencing uit waardevolle menselijke nierweefselmonsters te geleiden. We presenteren ook kwaliteitscontroleparameters om de toereikendheid van de verzamelde specimens te kunnen beoordelen. De workflow die in dit manuscript wordt beschreven, toont de haalbaarheid van deze aanpak om subsegmentale transcriptomische handtekeningen met veel vertrouwen te isoleren. De hier gepresenteerde methodologische benadering kan ook worden toegepast op andere weefseltypen met vervanging van relevante antilichaammarkers.
Introduction
Technologische vooruitgang bij het bestuderen van weefselmonsters heeft het begrip van de gezondheidstoestand en ziekte in verschillende organen verbeterd. Dergelijke vooruitgang heeft onderstreept dat pathologie kan beginnen in beperkte regio’s of in specifieke celtypen, maar toch belangrijke implicaties heeft voor het hele orgaan. Daarom is het in het huidige tijdperk van gepersonaliseerde geneeskunde belangrijk om de biologie op zowel cel- als regionaal niveau te begrijpen en niet alleen wereldwijd1. Dit geldt met name voor de nier, die bestaat uit verschillende gespecialiseerde cellen en structuren die differentieel initiëren en/of reageren op pathologische stress. De pathogenese van verschillende soorten menselijke nierziekte is nog steeds niet goed begrepen. Het genereren van een methodologie om veranderingen in genexpressie in specifieke buisvormige segmenten, structuren of gebieden van het interstitium in de menselijke nier te bestuderen, zal het vermogen vergroten om regiospecifieke veranderingen te ontdekken die kunnen informeren over de pathogenese van ziekte.
Menselijke nierbiopsie-exemplaren zijn een beperkte en kostbare hulpbron. Daarom moeten technologieën die transcriptomics in nierweefsel ondervragen, worden geoptimaliseerd om weefsel te bezuinigen. De beschikbare methoden om transcriptomics op cel- en regionaal niveau te bestuderen omvatten single cell RNA sequencing (scRNaseq), single nuclear RNaseq (snRNaseq), in situ spatial hybridization en laser microdissection (LMD). Dit laatste is zeer geschikt voor een nauwkeurige isolatie van regio ‘s of structuren die van belang zijn binnen weefselsecties , voor downstream RNA-sequencing en -analyse2,3,4,5. LMD kan worden gebruikt om te vertrouwen op identificatie van specifieke celtypen of structuren op basis van gevalideerde markers met behulp van op fluorescentie gebaseerde beeldvorming tijdens dissectie.
De unieke kenmerken van lasermicrodissectie ondersteunde regionale transcriptomics omvatten: 1) het behoud van de ruimtelijke context van cellen en structuren, die eenmalige celtechnologieën aanvult waar cellen worden geïdentificeerd door expressie in plaats van histologisch; 2) de technologie informeert en wordt geïnformeerd door andere beeldvormingstechnologieën omdat een antilichaammarker expressiehandtekeningen definieert; 3) het vermogen om structuren te identificeren, zelfs wanneer markers veranderen in ziekte; 4) detectie van laag uitgedrukte transcripties in ongeveer 20.000 genen; en 5) opmerkelijke weefseleconomie. De technologie is schaalbaar voor een nierbiopsie met een dikte van minder dan 100 μm van een kern die nodig is voor voldoende RNA-acquisitie en maakt het gebruik van gearchiveerd bevroren weefsel mogelijk, dat algemeen beschikbaar is in grote repositories of academische centra6.
In het daaropvolgende werk beschrijven we de regionale en bulk transcriptomics-technologie in detail, geoptimaliseerd met een nieuw protocol voor snelle fluorescentiekleuring voor gebruik met menselijk nierweefsel. Deze aanpak verbetert klassieke LMD-verkenningen omdat het afzonderlijke expressiegegevens biedt voor de subsegmenten interstitium en nephron in tegenstelling tot geaggregeerde tubulo-interstitiële expressie. Inbegrepen zijn de kwaliteitsborgings- en controlemaatregelen die zijn genomen om strengheid en reproduceerbaarheid te waarborgen. Het protocol maakt visualisatie van cellen en interessegebieden mogelijk, wat resulteert in een bevredigende verwerving van RNA uit deze geïsoleerde gebieden om downstream RNA-sequencing mogelijk te maken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transcriptomics op basis van LMD is een nuttige technologie die genexpressie verankert naar specifieke gebieden in het weefsel. De basis van deze technologie en de mogelijke toepassing ervan in de nier is eerder beschreven8. Optimalisatie, modernisering en stroomlijning van fluorescentie-gebaseerde dissectie specifiek gericht op hoge nauwkeurigheid dissectie voor downstream RNA sequencing is echter minder alomtegenwoordig. Omdat deze methodologie ruimtelijk geaard is in het weefsel, heeft het het …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Algemeen: De auteurs willen de onderzoekers van het Kidney Precision Medicine Project (www.kpmp.org) bedanken voor hun gracieuze steun en advies.
Financiering: De NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.) heeft dit werk ondersteund; NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Onderzoek in dit manuscript werd ondersteund door het National Institute of Diabetes and Digestive and the Kidney Diseases (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP), (www.kpmp.org), onder awardnummer U2CDK114886.
Beschikbaarheid van gegevens en materialen: Gegevens worden gearchiveerd in de Gene Expression Omnibus (GEO # pending)
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett’s esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection. Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. Laser capture microdissection of kidney tissue. Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).
- Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
- . Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf (2016)
- Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis. Physiological Reports. 3 (2), (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).
- Hipp, J. D., et al. Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools. Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).
