Применение лазерной микродиссеции для раскрытия региональной транскриптомики в тканях почек человека
Summary
Мы описываем протокол лазерного микропереписьа подсегментов человеческой почки, включая гломерул, проксимальные трубочку, толстую восходящую конечность, сбор протока и интерстиция. Затем РНК изолируются из полученных отсеков, и секвенирование РНК осуществляется для определения изменений в транскрипцио-подписи в каждом подразиме.
Abstract
Анализ экспрессии генов тканей почек человека является важным инструментом для понимания гомеостаза и патофизиологии заболеваний. Необходимо увеличить разрешение и глубину этой технологии и расширить ее до уровня клеток в тканях. Хотя использование одноядерной и одноклеточной РНК-секвенирования получило широкое распространение, экспрессионные сигнатные знаки клеток, полученных в результате диссоциации тканей, не поддерживают пространственного контекста. Лазерная микроперепись (ЛМД) на основе специфических флуоресцентных маркеров позволит изоляции конкретных структур и клеточных групп, представляющих интерес с известной локализации, тем самым позволяя приобретение пространственно якорных транскриптомных подписей в ткани почек. Мы оптимизировали методологию LMD, руководствуясь быстрым пятном на основе флуоресценции, чтобы изолировать пять различных отсеков в почках человека и провести последующее секвенирование РНК из ценных образцов тканей почек человека. Мы также представляем параметры контроля качества, позволяющие оценить адекватность собранных образцов. Рабочий процесс, изложенный в этой рукописи, показывает осуществимость такого подхода к изоляции подкломентальных транскриптомных подписей с высокой достоверностью. Представленный здесь методологический подход может быть применен и к другим типам тканей с заменой соответствующих маркеров антител.
Introduction
Технологический прогресс в изучении образцов тканей улучшил понимание состояния здоровья и заболеваний в различных органах. Такие достижения подчеркивают, что патология может начаться в ограниченных регионах или в конкретных типах клеток, но имеют важные последствия для всего органа. Поэтому в нынешнюю эпоху персонализированной медицины важно понимать биологию как на клеточном, так и на региональном уровне, а не только глобально1. Это особенно верно в почках, которая состоит из различных специализированных клеток и структур, которые дифференцированно инициировать и / или реагировать на патологический стресс. Патогенез различных типов заболеваний почек человека до сих пор не очень хорошо изучен. Создание методологии для изучения изменений экспрессии генов в конкретных трубчатых сегментах, структурах или областях интерстиция в почках человека повысит способность выявить конкретные изменения региона, которые могли бы информировать о патогенеза болезни.
Образцы биопсии почек человека являются ограниченным и ценным ресурсом. Поэтому технологии, допрашивающие транскриптомику в тканях почек, должны быть оптимизированы для экономии тканей. Доступные методы изучения транскриптомики на клеточном и региональном уровне включают одноклеточное секвенирование РНК (scRNaseq), одноядерную RNaseq (snRNaseq), пространственную гибридизацию на месте и лазерное микродиссекцию (LMD). Последний хорошо подходит для точной изоляции регионов или структур, представляющих интерес в секциях тканей, для секвенирования ианализа РНК вниз по течению 2,3,4,5. LMD может быть принят, чтобы полагаться на идентификацию конкретных типов клеток или структур на основе проверенных маркеров с использованием флуоресценции на основе изображений во время вскрытия.
Уникальные особенности лазерной микроперепись помощь региональной транскриптомики включают в себя: 1) сохранение пространственного контекста клеток и структур, который дополняет одноклеточных технологий, где клетки идентифицируются по выражению, а не гисто логики; 2) технология информирует и информируется другими технологиями визуализации, потому что маркер антител определяет экспрессионные подписи; 3) способность определять структуры даже при изменении маркеров заболевания; 4) обнаружение низко выраженных транскриптов примерно в 20 000 генов; и 5) замечательная экономия тканей. Технология масштабируется для биопсии почек с толщиной менее 100 мкм ядра, необходимого для достаточного приобретения РНК и позволяет использовать архивные замороженные ткани, которые обычно доступны в крупных хранилищах или академическихцентрах 6.
В последующей работе мы подробно описываем региональную и объемную технологию транскриптомики, оптимизированную новым протоколом быстрого окрашивания флуоресценции для использования в почечной ткани человека. Этот подход улучшает классические исследования LMD, поскольку он обеспечивает отдельные данные выражения для интерстиций и нефронных подсектов, в отличие от агрегированного тубулоинтерстициального выражения. Включены меры по обеспечению качества и контролю, принятые для обеспечения строгости и воспроизводимости. Протокол позволяет визуализировать ячейки и области, представляющие интерес, что приводит к удовлетворительному приобретению РНК из этих изолированных районов, чтобы позволить секвенированию РНК ниже по течению.
Protocol
Representative Results
Discussion
Транскриптомика на основе LMD является полезной технологией, которая закрепляет экспрессию генов в определенных областях ткани. Основа этой технологии и ее потенциальное применение в почках было описано ранее8. Однако оптимизация, модернизация и оптимизация вскрытия на ос…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Общие: Авторы хотели бы поблагодарить исследователей проекта точной медицины почек (www.kpmp.org) за их любезное поддержку и советы.
Финансирование: Поддержку этой работе оказал NIH/NIDDK K08DK107864 (M.T.E.); NIH/NIDDK UG3DK114923 (T.M.E., P.C.D.); R01DK099345 (T.A.S.). Исследования, о них сообщается в этой рукописи, были поддержаны Национальным институтом диабета и заболеваний пищеварения и заболеваний почек (NIDDK) Kidney Precision Medicine Project (KPMP) (www.kpmp.org), под номером U2CDK114886.
Доступность данных и материалов: Данные архивируются в Omnibus экспрессии генов (GEO )
Materials
| Acetone | Sigma-Aldrich | 270725-1L | |
| AMPure Beads | Beckman Coulter | A63880 | |
| Bioanalyzer | Agilent | 2100 | |
| BSA | VWR | 0332-100G | |
| DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
| Desiccant Cartridge | Bel-Art | F42046-0000 | |
| DNAse | Qiagen | 79254 | RDD buffer is included in the pakage |
| Laser Microdissection Microscope | Leica | LMD6500 | |
| Megalin/LRP2 Antibody | Abcam | ab76969 | Directly conjugated to Alexa Fluor 568 |
| Microcentrifuge tubes | ThermoFisher | AB-0350 | |
| Microscope camera | Leica | DFC700T | |
| PBS (RNAse Free) | VWR | K812-500ML | |
| Phalloidin (Oregon Green 488) | ThermoFisher | O7466 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | KIT0204 | |
| PPS-membrane slides | Leica | 11505268 | |
| qPCR Human Reference Total RNA 25 µg | Takara Clontech | 636690 | |
| RNA 6000 Eukaryote Total RNA Pico Chip | Agilent | 5067-1513 | |
| RNAse Away | ThermoFisher | 7000 | |
| RNAse Inhibitor | ThermoFisher | AM2696 | |
| Sequencer (HiSeq or NovaSeq) | Illumina | NA | |
| SMARTer Stranded Total RNAseq Pico Input v2 | Takara Clontech | 634411 | |
| Tamm-Horsfall Protein Antibody | R&D Systems | AF5144 | Directly conjugated to Alexa Fluor 546 |
| Tissue-Tek® O.C.T. Compound | Sakura | 4583 |
References
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett’s esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 44 (7), 787-795 (2009).
- Kohda, Y., Murakami, H., Moe, O. W., Star, R. A. Analysis of segmental renal gene expression by laser capture microdissection. Kidney International. 57 (1), 321-331 (2000).
- Murakami, H., Liotta, L., Star, R. A. IF-LCM: laser capture microdissection of immunofluorescently defined cells for mRNA analysis rapid communication. Kidney International. 58 (3), 1346-1353 (2000).
- Woroniecki, R. P., Bottinger, E. P. Laser capture microdissection of kidney tissue. Methods in Molecular Biology. 466, 73-82 (2009).
- Noppert, S. J., Eder, S., Rudnicki, M. Laser-capture microdissection of renal tubule cells and linear amplification of RNA for microarray profiling and real-time PCR. Methods in Molecular Biology. 755, 257-266 (2011).
- Amini, P., et al. An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing. BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).
- . Catalytic FFPE Nucleic Acid Isolation for best NGS Performance Available from: https://celldatasci.com/products/RNAstorm/RNAstorm_Technical_Note.pdf (2016)
- Micanovic, R., Khan, S., El-Achkar, T. M. Immunofluorescence laser micro-dissection of specific nephron segments in the mouse kidney allows targeted downstream proteomic analysis. Physiological Reports. 3 (2), (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communications. 10 (1), 2832 (2019).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in Molecular Biology. 980, 61-120 (2013).
- Hipp, J. D., et al. Computer-Aided Laser Dissection: A Microdissection Workflow Leveraging Image Analysis Tools. Journal of Pathology Informatics. 9, 45 (2018).
