Het minimaliseren van Hypoxie in Hippocampal Slices van volwassen en oudere muizen
Summary
Dit is een protocol voor acute slice voorbereiding van volwassen en veroudering muis hippocampi die gebruik maakt van transcardiale perfusie en slice snijden met ijskoude NMDG-aCSF om hypoxische schade aan het weefsel te verminderen. De resulterende plakjes blijven gedurende vele uren gezond en zijn geschikt voor langdurige patch-clamp en field-recordings.
Abstract
Acute hippocampal plakjes hebben generaties neurowetenschappers in staat gesteld om synaptische, neuronale en circuit eigenschappen in detail en met hoge trouw te verkennen. Verkenning van LTP- en LTD-mechanismen, enkelvoudige neuron dendritische berekening en ervaringsafhankelijke veranderingen in circuits zouden niet mogelijk zijn geweest zonder deze klassieke voorbereiding. Echter, met een paar uitzonderingen, meest elementaire onderzoek met behulp van acute hippocampal plakjes is uitgevoerd met behulp van plakjes van knaagdieren van relatief jonge leeftijden, ~ P20-P40, hoewel synaptische en intrinsieke prikkelbaarheid mechanismen hebben een lange ontwikkelingsstaart die voorbij P60 bereikt. De belangrijkste aantrekkingskracht van het gebruik van jonge hippocampal plakjes is het behoud van neuronale gezondheid geholpen door een hogere tolerantie voor hypoxische schade. Echter, Er is een noodzaak om neuronale functie te begrijpen in meer volwassen stadia van ontwikkeling, verder geaccentueerd door de ontwikkeling van verschillende dierlijke modellen van neurodegeneratieve ziekten die een veroudering van de hersenen voorbereiding vereisen. Hier beschrijven we een wijziging aan een acute hippocampal slice voorbereiding die betrouwbaar levert gezonde plakjes van volwassen en veroudering muis hippocampi. De kritieke stappen van het protocol zijn transcardiale perfusie en snijden met ijskoude natriumvrije NMDG-aSCF. Samen verzachten deze stappen de door hypoxie veroorzaakte daling van atp bij onthoofding, evenals cytotoxisch oedeem veroorzaakt door passieve natriumfluxen. We laten zien hoe transversale plakjes hippocampus plus cortex kunnen snijden met behulp van een trillende microtome. Acute hippocampal plakjes verkregen op deze manier zijn betrouwbaar gezond gedurende vele uren van de opname, en zijn geschikt voor zowel veld-opnames en gerichte patch-klem opnames, met inbegrip van targeting van fluorescerend gelabeld neuronen.
Introduction
De komst van zoogdier acute hersenen slice preparaten vergemakkelijkt experimenten op cellulair en synaptisch niveau die voorheen alleen mogelijk waren in ongewervelde preparaten zoals Aplysia1. Ontwikkeling van acute hippocampal plakjes was van bijzonder belang, want het is een structuur die verantwoordelijk is voor het werkgeheugen en contextvorming, en heeft een gespecialiseerde tri-synaptische circuits die vatbaar is voor eenvoudige fysiologische manipulatie. Echter, de overgrote meerderheid van de acute hersenen plakjes zijn nog steeds bereid van relatief jonge muizen en ratten, want het is gemakkelijker om gezonde neuronen en circuits te behouden, en de plakjes levensvatbaar blijven voor langere tijd2,3,4. Hier introduceren we wijzigingen in standaard snijprotocollen die resulteren in een verhoogde levensvatbaarheid van acute hippocampale plakjes van volwassen en oudere muizen.
De belangrijkste belemmering voor de lange termijn ex vivo levensvatbaarheid van zoogdier hersenen parenchyma is de eerste hypoxische schade die snel optreedt zodra de bloedtoevoer naar de hersenen stopt na onthoofding. Verlies van zuurstof resulteert in een snelle metabole consumptie van belangrijke energiebronnen in de hersenen met het verlies van fosfo-creatine (P-creatine) is de snelste, gevolgd door glucose, adenosine triphosfate (ATP), en glycogeen4. Behoud van ATP is van bijzonder belang voor de gezondheid op lange termijn van de hersenen plakjes, zoals ATP nodig is om het membraan potentieel te behouden via de Na-K ATPase, en dus de neurale activiteit5,6. Het ATP-niveau in het volwassen knaagdierbrein is ~2,5 mM, en het daalt snel binnen 20 s van onthoofding om een basale steady state (~0,5 mM) te bereiken op ongeveer 1 min na de onthoofding4,7,8. Bij jonge dieren duurt het langer om dezelfde daling van de ATP (~ 2 min) waar te nemen; met fenobarbital anesthesie wordt het verder vertraagd tot 4 min4. Deze overwegingen tonen aan dat het voorkomen van verlies van ATP en andere energiebronnen is een noodzakelijke strategie om hypoxische schade aan de hersenen te voorkomen en op zijn beurt om de gezondheid van de hersenen plakjes te handhaven over langere perioden van tijd, vooral bij volwassen dieren.
Lage temperaturen vertragen de stofwisseling. Bijgevolg is aangetoond dat bescheiden onderkoeling de energiereserves van de hersenen beschermt: bij jonge dieren, waarbij de lichaamstemperatuur met zes graden wordt verlaagd, van 37 °C tot 31 °C, behoudt atp-niveaus tot ongeveer 80% van de normale niveaus meer dan 4 uur van gecontroleerde hypoxie9. P-creatine niveaus zijn eveneens bewaard gebleven, evenals de totale fosforylatie potentieel9. Dit suggereert dat het verlagen van de lichaamstemperatuur voorafgaand aan onthoofding neuroprotectieve zou kunnen zijn, als bijna-normale niveaus van ATP kan worden gehandhaafd door de slice snijden en slice herstel periodes.
In de mate dat een ATP-daling bij onthoofding niet volledig kan worden voorkomen, wordt een gedeeltelijk verminderde functie van de Na-K ATPase verwacht, gevolgd door depolarisatie via passieve natriuminstroom. Als de passieve natrium instroom wordt gevolgd door water binnenkomst in cellen, het veroorzaakt cytotoxisch oedeem en uiteindelijk pyknosis. Bij volwassen ratten is het vervangen van Na+ ionen door sacharose in slice-cutting oplossingen een succesvolle strategie geweest om de last van cytotoxisch oedeem10,11te verlichten . Meer recentelijk hebben gemethyleerde organische kations die de doorlaatbaarheid van natriumkanaal verminderen12, aangetoond dat ze een effectievere bescherming bieden dan sacharose, vooral in plakjes van volwassen muizen, waarbij N-methyl-D-glucamine (NMDG) het meest van toepassing is in verschillende leeftijden en hersengebieden13,14,15,16.
Tal van brein-snijden protocollen betrekken het gebruik van koude temperaturen alleen tijdens de slice-cutting stap, soms in combinatie met Na+ ionvervanging strategie16,17. Bij jonge dieren lijken deze protocollen voldoende neuroprotectie te bieden, omdat de hersenen snel na onthoofding kunnen worden geëxtraheerd omdat de schedel nog dun is en gemakkelijk te verwijderen3. Deze strategie produceert echter geen gezonde plakjes van volwassen dieren. Na verloop van tijd hebben een aantal laboratoria die volwassen knaagdieren bestuderen transcardiale perfusie geïntroduceerd met een ijskoude oplossing om de lichaamstemperatuur van het dier te verlagen, en dus hypoxische schade aan de hersenen, voorafgaand aan onthoofding. Deze procedure werd met succes toegepast op de productie van cerebellar plakjes18, midbrain plakjes19, neocorticale plakjes11,20, perirhinale cortex21, rat hippocampus10,22,23, reukbol24, ventrale striatum25, visuele cortex26.
Ondanks de voordelen die transcardiale perfusie en Na+ ionenvervanging bieden bij het bereiden van plakjes ratten en in sommige hersengebieden bij muizen, blijft muis hippocampus een van de meest uitdagende gebieden om te beschermen tegen hypoxie13,20. Tot op heden, een van de meest voorkomende benaderingen voor het snijden hippocampus van veroudering muizen en muis modellen van neurodegeneratie omvat de klassieke snelle snijden van de geïsoleerde hippocampi27. In het hier beschreven protocol minimaliseren we het verlies van ATP in de volwassen hersenen door onderkoeling te introduceren voorafgaand aan de onthoofding door het dier transcardieel te doorbrengen met ijskoude Na+– gratis op NMDG gebaseerde kunstmatige hersenvocht (NMDG-aCSF). Plakjes worden vervolgens gesneden in ijskoude Na+-vrije NMDG-aCSF. Met dit verbeterde protocol verkrijgen we acute hippocampal plakjes van volwassen en oudere muizen die gezond zijn voor maximaal 10 uur na het snijden en geschikt zijn voor lange termijn veldopnames en patch-clamp studies.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het hier beschreven protocol toont aan dat hippocampale plakjes verkregen van volwassen en oudere muizen gezond en levensvatbaar kunnen blijven gedurende vele uren na het snijden. De segmenten die met dit protocol zijn bereid, zijn geschikt voor patch-clamp-opnames, evenals langdurige veldopnames in de CA1-regio’s.
Er zijn twee kritieke stappen in dit protocol. Eerste stap is de transcardiale perfusiestap met een ijskoude oplossing. Snelle klaring van het bloed wordt gesignaleerd door een snel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ik dank Dr. Carla J. Shatz voor advies en ondersteuning, en Dr. Barbara K. Brott en Michelle K. Drews voor het kritisch lezen van het manuscript. Het werk wordt ondersteund door NIH EY02858 en de Mathers Charitable Foundation subsidies aan CJS.
Materials
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) – porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
- Glanzman, D. L. The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants. Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).
- Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain. Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus. Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus. Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).
- Free Mandel, P. H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals. Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).
- Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).
- Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats. Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).
- Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons. Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex. Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).
- Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).
- Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. . Patch-Clamp Methods and Protocols. 1183, 221-242 (2014).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 1-10 (2015).
- Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids. Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).
- Djurisic, M., et al. PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).
- Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
- Blot, A., Barbour, B. Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau. Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).
- Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli. Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).
- Frick, A., Magee, J., Johnston, D. LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites. Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).
- Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell. PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).
- Brooks, J. M., O’Donnell, P. Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).
- Goel, A., Lee, H. K. Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex. Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).
- Izumi, Y., Zorumski, C. F. Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices. Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).
- Hajos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
- . Hippocampus Rat Available from: https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat (1999)
- Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons. Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
