מזעור היפוקסיה בפרוסות היפוקמפוס מעכברים מבוגרים ומזדקנים
Summary
זהו פרוטוקול להכנת פרוסה חריפה מהיפוקמפוס עכבר מבוגר ומזדקן המנצל את התסיסה הקרדיאלית וחיתוך פרוסה עם NMDG-aCSF קר כקרח כדי להפחית את הנזק היפוקסי לרקמות. הפרוסות המתוברות נשארות בריאות במשך שעות רבות, ומתאימים לטלאים ארוכי טווח ולהקלטות שדה.
Abstract
פרוסות היפוקמפוס אקוטי אפשרו דורות של מדעני מוח לחקור תכונות סינפטיות, עצביות, ומעגל בפירוט ובנאמנות גבוהה. חקירה של מנגנוני LTP ו-LTD, חישוב דנדריטי נוירון יחיד, ושינויים תלויי ניסיון במעגלים, לא היו אפשריים ללא הכנה קלאסית זו. עם זאת, עם כמה יוצאים מן הכלל, המחקר הבסיסי ביותר באמצעות פרוסות היפוקמפוס חריפה בוצע באמצעות פרוסות מכרסמים של גילים צעירים יחסית, ~ P20-P40, למרות מנגנוני עירור סינפטיים פנימיים יש זנב התפתחותי ארוך שמגיע מעבר P60. הערעור העיקרי של שימוש בפרוסות היפוקמפוס צעירות הוא שימור של בריאות עצבית בסיוע סובלנות גבוהה יותר לנזק היפוקסי. עם זאת, יש צורך להבין את התפקוד העצבי בשלבים בוגרים יותר של התפתחות, מודגש עוד יותר על ידי התפתחות מודלים שונים של בעלי חיים של מחלות ניווניות הדורשות הכנה מוחית מזדקנת. כאן אנו מתארים שינוי בהכנת פרוסת היפוקמפוס חריפה המספקת באופן אמין פרוסות בריאות מהיפוקמפוס עכבר מבוגר ומזדקן. השלבים הקריטיים של הפרוטוקול הם זיעה וחיתוך בין-לב וחיתוך עם NMDG-aSCF ללא נתרן קר כקרח. יחד, שלבים אלה להחית את הירידה המושרה היפוקסיה ATP על עריפת ראש, כמו גם בצקת ציטוקוקסית הנגרמת על ידי שטף נתרן פסיבי. אנו מדגימים כיצד לחתוך פרוסות טרנסוורס של היפוקמפוס בתוספת קליפת המוח באמצעות מיקרוטומיה רוטטת. פרוסות היפוקמפוס אקוטיות שהושגו בדרך זו הן בריאות באופן מהימנים במשך שעות רבות של הקלטה, והן מתאימות הן להקלטות שדה והן להקלטות ממוקדות של מהדק טלאי, כולל מיקוד של נוירונים המסומנים בפלורסנט.
Introduction
הופעתם של ההכנות לחתיכה מוחית חריפה של היונקים הקלה על ניסויים ברמה התאית והסינופטית שהיו אפשריים בעבר רק בהכנות חסרי חוליות כמו Aplysia1. פיתוח פרוסות היפוקמפוס אקוטיות היה בעל משמעות מיוחדת, כפי שהוא מבנה אחראי על זיכרון עבודה היווצרות הקשר, ויש לו מעגלים תלת-סינפטיים מיוחדים כי הוא נוח מניפולציה פיזיולוגית קלה. עם זאת, הרוב המכריע של פרוסות מוח אקוטיות עדיין מוכנים מעכברים וחולדות צעירים יחסית, כפי שקל יותר לשמר נוירונים ומעגלים בריאים, ואת הפרוסות להישאר קיימא לפרקיזמן ארוכים יותר 2,,3,,4. כאן, אנו מציגים שינויים בפרוטוקולי חיתוך סטנדרטיים התוצאתם כדאיות מוגברת של פרוסות היפוקמפוס אקוטיות מעכברים בוגרים ומזדקנים.
המכשול העיקרי לכדאיות vivo לשעבר לטווח ארוך של parenchyma המוח יונקים הוא הנזק היפוקסי הראשוני המתרחשת במהירות ברגע זרימת הדם למוח מפסיק בעקבות עריפת ראש. אובדן חמצן גורם לצריכה חילוף חומרים מהירה של משאבי אנרגיה עיקריים במוח עם אובדן של פוספו-קריאטין (P-קריאטין) להיות המהיר ביותר, ואחריו גלוקוז, אדנוזין טריפוספט (ATP), וגלוקוגן4. שימור ATP הוא בעל חשיבות מיוחדת לבריאות לטווח ארוך של פרוסות מוח, כמו ATP נדרש כדי לשמור על פוטנציאל קרום באמצעות ATPase Na-K, וכתוצאה מכך את הפעילותהעצבית 5,6. רמת ה-ATP במוח המכרסמים הבוגרים היא כ-2.5 מ”מ, והיא יורדת במהירות בתוך 20 שניות של עריפת ראש כדי להגיע למצב יציב של בסיס (כ-0.5 מ”מ) בסביבות דקה לאחר עריפתראש 4,,7,,8. בבעלי חיים צעירים, לוקח יותר זמן לצפות באותה ירידה ATP (~ 2 דקות); עם הרדמה פנוברביטל הוא הואט עוד יותר 4 דקות4. שיקולים אלה מראים כי מניעת אובדן ATP ומשאבי אנרגיה אחרים היא אסטרטגיה הכרחית כדי למנוע נזק היפוקסי למוח ובכך כדי לשמור על הבריאות של פרוסות המוח על פני פרקי זמן ארוכים יותר, במיוחד בבעלי חיים בוגרים.
טמפרטורות נמוכות מאטות את חילוף החומרים. כתוצאה מכך, הוכח כי היפותרמיה צנועה מגנה על עתודות אנרגיית המוח: בבעלי חיים צעירים, הורדת טמפרטורת הגוף בשש מעלות, מ 37 °C ל 31 ° C, משמרת את רמות ATP סביב 80% של רמות נורמליות מעל 4 שעות של היפוקסיהמבוקרת 9. רמות P-קריאטין נשמרים באופן דומה, כמו גם פוטנציאל פוספורילציההכוללת 9. זה מצביע על כך שהורדת טמפרטורת הגוף לפני עריפת ראש יכול להיות neuroprotective, כמו רמות כמעט נורמליות של ATP יכול להישמר באמצעות חיתוך פרוסה ופרוסה התאוששות תקופות.
במידה כי ירידה ATP לא ניתן למנוע לחלוטין על עריפת ראש, פונקציה לקויה חלקית של ATPase Na-K צפוי, ואחריו depolarization באמצעות זרם נתרן פסיבי. כמו זרם נתרן פסיבי מלווה בכניסת מים לתאים, זה גורם בצקת ציטוקוקסית ובסופו של דבר פיקנוזיס. בחולדות בוגרות, החלפת יונים Na+ עם סוכרוז בפתרונות חיתוך פרוסה כבר אסטרטגיה מוצלחת כדי להקל על הנטל של בצקת cytotoxic10,11. לאחרונה, cations אורגני מתילציה המפחיתים חחולערוץ נתרן 12 הראו להציע הגנה יעילה יותר מאשר סוכרוז, במיוחד פרוסות מעכברים בוגרים, עם N-מתיל-D-גלוקמין (NMDG) להיות ישים ביותר על פני גילאים שונים ואזורי מוח13,,14,,15,,16.
פרוטוקולים רבים לחיתוך מוח כרוכים בשימוש בטמפרטורות קרות רק במהלך שלב חיתוך הפרוסה, לעתים בשילוב עם Na+ ion החלפתאסטרטגיה 16,17. בבעלי חיים צעירים, פרוטוקולים אלה מופיעים להציע הגנה עצבית מספקת מאז המוח ניתן לחלץ במהירות לאחר עריפת ראש כי הגולגולת היא עדיין רזה וקל להסיר3. עם זאת, אסטרטגיה זו אינה מייצרת פרוסות בריאות מבעלי חיים בוגרים. עם הזמן, מספר מעבדות החוקרות מכרסמים בוגרים הציגו זיעה בין-לבית עם תמיסה קרה כקרח כדי להקטין את טמפרטורת הגוף של החיה, ולכן נזק היפוקסי למוח, לפני עריפת ראש. הליך זה הוחל בהצלחה כדי לייצר פרוסות המוח18, פרוסות המוח האמצעי19, פרוסות neocortical11,20, קליפת פריהינלית21, היפוקמפוסחולדה 10,22,23, נורהחוש הריח 24, סטריאטוםאוורור 25, קליפת המוח,החזותית 26.
למרות היתרונות המוצעים על ידי עירוי transcardial ו Na+ תחליף יון בהכנת פרוסות מעכברוש ובאיזורים מסוימים במוח בעכברים, היפוקמפוס העכבר נשאר אחד האזורים המאתגרים ביותר כדי להגן מפני היפוקסיה13,20. עד כה, אחת הגישות הנפוצות ביותר לחיתוך היפוקמפוס מעכברים מזדקנים ומודלים עכבר של ניוון עצבי כרוך חיתוך מהיר קלאסי של היפוקמפוס מבודד27. בפרוטוקול המתואר כאן, אנו ממזערים את אובדן ATP במוח הבוגר על ידי הצגת היפותרמיה לפני עריפת הראש על ידי חפירת החיה באופן טראנס-קר עם Na קר כקרח+– נוזל מוחי מוחי מלאכותי מבוסס NMDG חינם (NMDG-aCSF). לאחר מכן, הפרוסות נחתכו ב-Naהקר כקרח +NMDG-aCSF ללא תשלום. עם פרוטוקול משופר זה אנו מקבלים פרוסות היפוקמפוס חריפה מעכברים בוגרים ומזדקנים כי הם בריאים עד 10 שעות לאחר חיתוך ומתאימים לטווח ארוך שדה הקלטות מחקרים טלאי-מהדק.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר כאן מדגים כי פרוסות היפוקמפוס המתקבלות מעכברים מבוגרים ומזדקנים יכולים להישאר בריאים וכדאיים במשך שעות רבות לאחר החיתוך. הפרוסות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה מתאימות להקלטות של מהדק-תיקון, כמו גם להקלטות שדה לאורך זמן באזורי CA1.
קיימים שני שלבים קריטיים בפר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אני מודה לד”ר קרלה ג’יי שץ על ייעוץ ותמיכה, וד”ר ברברה ק. בראט ומישל ק. דוקס על שקראו את כתב היד באופן ביקורתי. העבודה נתמכת על ידי NIH EY02858 וקרן הצדקה מאת’רס מעניקה ל-CJS.
Materials
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) – porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
- Glanzman, D. L. The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants. Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).
- Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain. Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus. Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus. Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).
- Free Mandel, P. H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals. Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).
- Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).
- Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats. Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).
- Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons. Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex. Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).
- Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).
- Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. . Patch-Clamp Methods and Protocols. 1183, 221-242 (2014).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 1-10 (2015).
- Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids. Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).
- Djurisic, M., et al. PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).
- Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
- Blot, A., Barbour, B. Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau. Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).
- Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli. Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).
- Frick, A., Magee, J., Johnston, D. LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites. Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).
- Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell. PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).
- Brooks, J. M., O’Donnell, P. Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).
- Goel, A., Lee, H. K. Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex. Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).
- Izumi, Y., Zorumski, C. F. Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices. Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).
- Hajos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
- . Hippocampus Rat Available from: https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat (1999)
- Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons. Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
