成虫マウスおよび老化マウスからの海馬スライスにおける低酸素症の最小化
Summary
これは、経心面灌流と氷冷NMDG-aCSFによるスライス切断を利用して組織への低酸素損傷を軽減する、成体および老化マウス海馬からの急性スライス調製のためのプロトコルである。結果のスライスは、長時間にわたって健康を維持し、長期的なパッチクランプやフィールド記録に適しています。
Abstract
急性海馬スライスは、神経科学者の世代がシナプス、神経細胞、および回路特性を詳細かつ高忠実に探求することを可能にしました。LTPとLTDのメカニズムの探査、単一ニューロン樹状計算、回路の経験依存的変化は、この古典的な準備なしには不可能でした。しかし、いくつかの例外を除いて、シナプスおよび本質的な興奮性メカニズムがP60を過ぎて到達する長い発達尾を有するにもかかわらず、急性海馬スライスを使用してほとんどの基礎研究は、比較的若い年齢のげっ歯類からのスライスを使用して行われてきた〜P20-P40。若い海馬スライスを使用する主な魅力は、低酸素損傷に対する耐性の高い助けとなる神経細胞の健康の維持です。しかし、発達のより成熟した段階での神経機能を理解する必要があり、加齢脳準備を必要とする神経変性疾患の様々な動物モデルの開発によってさらに強調される。ここでは、成人および老化したマウス海馬から健康的なスライスを確実に送達する急性海馬スライス調製物の変更について説明する。プロトコルの重要なステップは、経心面灌流と氷冷ナトリウムフリーNMDG-aSCFによる切断です。これらのステップは、切断時のATPにおける低酸素低下と、受動ナトリウムフラックスによって引き起こされる細胞傷害性浮腫を減衰させる。振動マイクロトームを用いて海馬と皮質の横切りスライスをカットする方法を実演します。この方法で得られた急性海馬スライスは、記録の多くの時間にわたって確実に健康であり、蛍光標識ニューロンのターゲティングを含むフィールドレコーディングとターゲットパッチクランプ記録の両方に適しています。
Introduction
哺乳動物急性脳スライス製剤の出現は、以前はAplysia1のような無脊椎動物製剤でのみ可能であった細胞およびシナプスレベルでの実験を促進した。急性海馬スライスの開発は、ワーキングメモリとコンテキスト形成を担当する構造であり、容易な生理学的操作に適した特殊なトライシナプス回路を有するため、特に重要であった。しかし、急性脳スライスの大部分は、健康なニューロンおよび回路を維持する方が容易であり、スライスは22、3、43,4の長い期間生存可能なままであるため、比較的若いマウスおよびラットからまだ調製される。ここでは、成体および老化マウスからの急性海馬スライスの生存率を高める標準的なスライスプロトコルの変更を紹介する。
哺乳類の脳実質の長期的なex vivo生存率への主要な障害は、切断後に脳への血流が止まると急速に起こる最初の低酸素損傷である。酸素の損失は、ホスホクレアチン(P-クレアチン)の損失が最も急速である脳内の主要なエネルギー資源の速い代謝消費をもたらし、次いでグルコース、アデノシン三リン酸(ATP)、およびグリコーゲン4が続く。ATPの保存は、脳スライスの長期的な健康にとって特に重要であり、NA-K ATPaseを介して膜電位を維持するためにATPが必要であり、その結果、神経活動55、6。6成人げっ歯類脳のATPレベルは〜2.5mMであり、約1分の切断後4,4、7、8,8で基底定常状態(約0.5mM)に達するために切断の20s以内に急激に低下する。若い動物では、ATPの同じ低下を観察するのに時間がかかります(〜2分)。フェノバルビタール麻酔では4分4までさらに遅くなる。これらの考慮事項は、ATPおよび他のエネルギー資源の損失を防ぐことは、脳への低酸素損傷を防ぎ、特に成虫動物においてより長い期間にわたって脳スライスの健康を維持するために必要な戦略であることを示している。
低温は代謝を遅くする。その結果、控えめな低体温は脳エネルギー埋蔵量を保護することが実証されている:若い動物では、体温を6度下げ、37°Cから31°Cに、制御された低酸素の4時間にわたって正常レベルの約80%にATPレベルを維持する9。Pクレアチンレベルも同様に保存され、全体的なリン酸化電位9.これは、切断前の体温を下げることは、スライス切断およびスライス回復期間を通じてATPのほぼ正常レベルを維持することができるので、神経保護であり得ることを示唆している。
切断時にATP低下を完全に防止できない程度に、Na-K ATPaseの部分的に障害のある機能が期待され、続いて受動ナトリウム流入による脱分極化が予想される。受動的なナトリウム流入が続いて細胞への水の侵入が続くにつれて、細胞毒性の浮腫と最終的にピクノーシスを引き起こす。成虫ラットでは、スライス切断液中でNa+イオンをスクロースに置き換えることは、細胞傷害性浮腫10,11,11の負担を軽減する戦略として成功している。最近では、ナトリウムチャネル透過率,12を減少させるメチル化有機カチオンは、特に成体マウスからのスライスにおいて、特に成人マウスからのスライスにおいて、N-メチル-D-グルカミン(NMDG)が13、14、15、16の異なる13,14,15年齢および脳領域にわたって最も広く適用可能である、スクロースよりも効果的な保護を提供することが示されている。16
多くの脳スライスプロトコルは、スライス切断ステップ中にのみ冷たい温度を使用することを含み、時にはNa+イオン置換戦略16、17,17と組み合わせて。若い動物では、頭蓋骨はまだ薄く、取り除きが簡単なので、脳は切断後に迅速に抽出することができるので、これらのプロトコルは十分な神経保護を提供するように見える。しかし、この戦略は、成虫の動物から健康的なスライスを生成しません。時間が経つにつれて、成虫のげっ歯類を研究する多くの研究室は、動物の体温を低下させ、したがって切断前に脳に低酸素損傷を与えるために氷冷溶液で経心輸を導入してきた。この手順は、小脳スライス18、中脳スライス19、新皮質スライス11、20、20海中11皮質21、ラット海馬10、22、23、22,23嗅球10球24、腹側線条体25、視覚皮質26を生成するために正常に適用された。
ラットおよびマウスのいくつかの脳領域でのスライスを調製する術後灌流およびNa+イオン置換によって提供される利点にもかかわらず、マウス海馬は低酸素13、20,20から保護する最も困難な領域の1つである。現在までに、老化したマウスおよび神経変性のマウスモデルから海馬をスライスする最も一般的なアプローチの1つは、孤立した海馬27の古典的な高速スライスを伴う。ここで説明するプロトコルでは、動物に氷冷Na+-無料のNMDGベースの人工脳脊髄液(NMDG-aCSF)を経線的に浸透させることによって、切断前に低体温症を導入することにより、成人脳におけるATPの損失を最小限に抑える。スライスは、氷冷Na+-free NMDG-aCSFでカットされます。この強化されたプロトコルにより、スライス後最大10時間健康で、長期的なフィールドレコーディングやパッチクランプ研究に適した成体および老化マウスから急性海馬スライスを取得します。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルは、成体および老化マウスから得られた海馬スライスが切断後何時間も健康で生存可能であり続けることができることを示している。このプロトコルを使用して作成されたスライスは、パッチクランプの記録だけでなく、CA1リージョンでの長時間のフィールド記録に適しています。
このプロトコルには 2 つの重要な手順があります。最初のス?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
カーラ・J・シャッツ博士の助言と支援、バーバラ・K・ブロット博士、ミシェル・K・ドリューズ博士の原稿を批判的に読んでくださったことに感謝します。この作品はNIH EY02858とマザーズ慈善財団がCJSに助成金を提供しています。
Materials
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) – porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
- Glanzman, D. L. The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants. Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).
- Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain. Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus. Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus. Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).
- Free Mandel, P. H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals. Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).
- Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).
- Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats. Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).
- Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons. Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex. Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).
- Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).
- Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. . Patch-Clamp Methods and Protocols. 1183, 221-242 (2014).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 1-10 (2015).
- Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids. Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).
- Djurisic, M., et al. PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).
- Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
- Blot, A., Barbour, B. Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau. Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).
- Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli. Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).
- Frick, A., Magee, J., Johnston, D. LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites. Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).
- Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell. PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).
- Brooks, J. M., O’Donnell, P. Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).
- Goel, A., Lee, H. K. Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex. Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).
- Izumi, Y., Zorumski, C. F. Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices. Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).
- Hajos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
- . Hippocampus Rat Available from: https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat (1999)
- Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons. Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
