Минимизация гипоксии в гиппокампе ломтики от взрослых и старения мышей
Summary
Это протокол для острого приготовления ломтик от взрослых и старения мыши гиппокампа, который использует транскардиальной перфузии и ломтик резки с холодной льдий NMDG-ACSF для уменьшения гипоксического повреждения ткани. Полученные ломтики остаются здоровыми в течение многих часов, и подходят для долгосрочного патч-зажима и полевых записей.
Abstract
Острые ломтики гиппокампа позволили поколениям нейробиологов исследовать синаптические, нейронные и схемные свойства в деталях и с высокой точностью. Изучение механизмов LTP и LTD, одно нейрон дендритных вычислений и опытозависимых изменений в схеме было бы невозможно без этой классической подготовки. Тем не менее, за некоторыми исключениями, большинство фундаментальных исследований с использованием острых ломтиков гиппокампа была выполнена с использованием ломтиков от грызунов относительно молодого возраста, P20-P40, хотя синаптические и внутренние механизмы возбудимости имеют длинный хвост развития, который достигает прошлого P60. Основной привлекательностью использования молодых ломтиков гиппокампа является сохранение нейронов здоровья, которому способствует более высокая толерантность к гипоксическим повреждениям. Тем не менее, необходимо понимать функции нейронов на более зрелых стадиях развития, что еще больше усугубляется развитием различных животных моделей нейродегенеративных заболеваний, которые требуют старения мозга подготовки. Здесь мы описываем модификацию острого препарата гиппокампа ломтик, который надежно обеспечивает здоровые ломтики от взрослых и старения мыши гиппокампа. Критическими шагами протокола являются транскардиальная перфузия и резка с ледяной натрия без NMDG-ASCF. Вместе эти шаги смягчают гипоксию индуцированной капли в АТФ при обезглавливании, а также цитотоксический отек, вызванный пассивными потоками натрия. Мы демонстрируем, как сократить поперечные ломтики гиппокампа плюс кора с помощью вибрирующих микротомов. Острые гиппокампа ломтики, полученные таким образом, надежно здоровы в течение многих часов записи, и подходят как для полевых записей и целевых патч-зажим записей, в том числе ориентации флуоресцентно помечены нейронов.
Introduction
Появление млекопитающих острых препаратов кусок мозга способствовали эксперименты на клеточном и синаптическом уровне, которые ранее были возможны только в беспозвоночных препаратов, как Аплизия1. Особое значение имеет развитие острых ломтиков гиппокампа, так как это структура, отвечающая за рабочую память и контекстообразование, и имеет специализированную трехсинаптическую схему, которая поддается легкой физиологической манипуляции. Тем не менее, подавляющее большинство острых ломтиков мозга по-прежнему готовятся из относительно молодых мышей и крыс, так как легче сохранить здоровые нейроны и схемы, и ломтики остаются жизнеспособными в течение более длительных периодоввремени 2,3,4. Здесь мы вводим изменения в стандартные протоколы нарезки, которые приводят к повышению жизнеспособности острых ломтиков гиппокампа от взрослых и стареющих мышей.
Основным препятствием для долгосрочной ex vivo жизнеспособности млекопитающих мозга parenchyma является первоначальный гипоксический ущерб, который происходит быстро, как только поток крови к мозгу останавливается после обезглавливания. Потеря кислорода приводит к быстрому метаболическому потреблению основных энергетических ресурсов в головном мозге с потерей фосфо-креатина (P-креатина) является наиболее быстрым, а затем глюкозы, аденозинтрифосфата (АТФ), и гликоген4. Сохранение АТФ имеет особое значение для долгосрочного здоровья ломтиков мозга, так как АТФ необходим для поддержания мембранного потенциала через Na-K ATPase, и, следовательно, нейронной активности5,6. Уровень АТФ в мозге взрослого грызуна составляет 2,5 мМ, и он резко падает в пределах 20 с обезглавливания, чтобы достичь базального устойчивого состояния (0,5 мМ) на уровне около 1 мин после обезглавливания4,7,8. У молодых животных, это занимает больше времени, чтобы наблюдать то же падение в АТФ (2 мин); с фенобарбитальной анестезией он далее замедлился до 4 мин4. Эти соображения показывают, что предотвращение потери АТФ и других энергетических ресурсов является необходимой стратегией для предотвращения гипоксического повреждения мозга и, в свою очередь, для поддержания здоровья ломтиков мозга в течение более длительных периодов времени, особенно у взрослых животных.
Низкие температуры замедляют обмен веществ. Следовательно, было продемонстрировано, что скромное переохлаждение защищает запасы энергии мозга: у молодых животных, снижая температуру тела на шесть градусов, с 37 градусов до 31 градусов по Цельсию, сохраняет уровни АТФ примерно до 80% от нормального уровня более 4 ч контролируемой гипоксии9. Уровни P-креатина также сохранены, также, как общий потенциал фосфорилирования9. Это говорит о том, что снижение температуры тела до обезглавливания может быть нейропротекторным, так как почти нормальные уровни АТФ могут поддерживаться через ломтик резки и ломтик периодов восстановления.
В той степени, что падение АТФ не может быть полностью предотвращено при обезглавливании, ожидается частично нарушенная функция Na-K ATPase, за которой последует деполяризация через пассивный приток натрия. Как пассивный приток натрия сопровождается водой вступления в клетки, он вызывает цитотоксический отек и в конечном итоге пикноз. У взрослых крыс, замена ионов Na’ с сахарозой в срез-резки решений была успешная стратегия, чтобы облегчить бремя цитотоксического отека10,11. Совсем недавно, метилированные органические катиции, которые уменьшают проницаемость канала натрия12 показали, чтобы предложить более эффективную защиту, чем сахароза, особенно в ломтики от взрослых мышей, с N-метил-D-глюкамин (NMDG) наиболее широко применимы в разных возрастов и мозговых регионах13,14,15,16.
Многочисленные протоколы нарезки мозга включают использование холодных температур только во время срезающего шага, иногда в сочетании со стратегией замены иона Naй 16,17. У молодых животных, эти протоколы, как представляется, предлагают достаточно нейрозащиты, так как мозг может быть извлечен быстро после обезглавливания, потому что череп все еще тонкий и легко удалить3. Тем не менее, эта стратегия не производит здоровые ломтики от взрослых животных. Со временем в ряде лабораторий, изучающих взрослых грызунов, введена транскардиальная перфузия с ледяным раствором для снижения температуры тела животного и, следовательно, гипоксического повреждения мозга до обезглавливания. Эта процедура была успешно применена для производства мозжечковых ломтиков18,ломтики среднего мозга19, неокортиковые ломтики11,20, периринальной коры21, крыса гиппокампа10,22,23,обонятельная луковица24, вентральная стриятная тум25, визуальная кора26.
Несмотря на преимущества, предлагаемые транскардиальной перфузии и Naион замены в подготовке ломтиков от крысы и в некоторых областях мозга у мышей, мышь гиппокампа остается одним из самых сложных областей для защиты от гипоксии13,20. На сегодняшний день, один из наиболее распространенных подходов к нарезке гиппокампа от старения мышей и мыши модели нейродегенерации включает в себя классические быстро нарезки изолированных гиппокампа27. В протоколе, описанном здесь, мы минимизируем потерю АТФ во взрослом мозгу, вводя переохлаждение до обезглавливания путем транскардиальной перфузии животного с ледянойNa– свободной NMDG основе искусственной спинномозговой жидкости (NMDG-aCSF). Ломтики затем вырезать в ледяной Na–бесплатноNMDG-aCSF. С помощью этого расширенного протокола мы получаем острые ломтики гиппокампа от взрослых и стареющих мышей, которые здоровы до 10 ч после нарезки и подходят для долгосрочных полевых записей и патч-зажим исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный здесь, показывает, что гиппокампе ломтики, полученные от взрослых и стареющих мышей может оставаться здоровым и жизнеспособным в течение многих часов после резки. Срезы, подготовленные с использованием этого протокола, подходят для записи патч-зажима, а также длите?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Я благодарю д-ра Карлу Дж. Шац за совет и поддержку, а д-р Барбара К. Брот и Мишель К. Дрюс за критическое прочтение рукописи. Работа поддерживается NIH EY02858 и Благотворительный фонд Mathers гранты CJS.
Materials
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) – porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
- Glanzman, D. L. The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants. Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).
- Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain. Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus. Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus. Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).
- Free Mandel, P. H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals. Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).
- Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).
- Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats. Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).
- Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons. Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex. Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).
- Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).
- Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. . Patch-Clamp Methods and Protocols. 1183, 221-242 (2014).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 1-10 (2015).
- Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids. Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).
- Djurisic, M., et al. PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).
- Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
- Blot, A., Barbour, B. Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau. Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).
- Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli. Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).
- Frick, A., Magee, J., Johnston, D. LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites. Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).
- Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell. PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).
- Brooks, J. M., O’Donnell, P. Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).
- Goel, A., Lee, H. K. Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex. Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).
- Izumi, Y., Zorumski, C. F. Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices. Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).
- Hajos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
- . Hippocampus Rat Available from: https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat (1999)
- Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons. Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
