Yetişkin ve Yaşlanan Farelerden Hipokampal Dilimlerde Hipoksinin En Aza Indirilmesi
Summary
Bu doku hipoksik hasarı azaltmak için buz gibi NMDG-aCSF ile transkardiyal perfüzyon ve dilim kesme yararlanır yetişkin ve yaşlanma fare hipokampi akut dilim hazırlanması için bir protokoldür. Elde edilen dilimler saatlerce sağlıklı kalır ve uzun süreli yama kıskaçları ve alan kayıtları için uygundur.
Abstract
Akut hipokampal dilimler nörolognesiller sinaptik keşfetmek için sağlamıştır, nöronal, ve ayrıntılı olarak devre özellikleri ve yüksek sadakat ile. LTP ve LTD mekanizmalarının araştırılması, tek nöron dendritik hesaplaması ve devrelerde deneyime bağlı değişiklikler, bu klasik hazırlık olmadan mümkün olamazdı. Ancak, birkaç istisna dışında, akut hipokampal dilimleri kullanarak en temel araştırma nispeten genç yaşlarda kemirgenler dilimleri kullanılarak yapılmıştır, ~ P20-P40, sinaptik ve içsel uyarılabilirlik mekanizmaları geçmiş P60 ulaşan uzun bir gelişimsel kuyruk olmasına rağmen. Genç hipokampal dilimleri kullanarak ana itiraz hipoksik hasara daha yüksek tolerans tarafından desteklenen nöronal sağlık korunmasıdır. Ancak, gelişmenin daha olgun aşamalarında nöronal fonksiyonu anlamak için bir ihtiyaç vardır, daha da yaşlanan bir beyin hazırlık gerektiren nörodejeneratif hastalıkların çeşitli hayvan modellerinin geliştirilmesi ile vurgulanan. Burada güvenilir yetişkin ve yaşlanma fare hipokampi sağlıklı dilimler sunar akut hipokampal dilim hazırlanması için bir değişiklik açıklar. Protokolün kritik adımları transkardiyal perfüzyon ve buz gibi sodyumiçermeyen NMDG-aSCF ile kesimdir. Birlikte, bu adımlar decapitation üzerine ATP hipoksilen damla zayıflatmak, yanı sıra pasif sodyum akılarının neden olduğu sitotoksik ödem. Titreşen bir mikrotom kullanarak hipokampus artı korteksin transversal dilimlerinin nasıl kesilen yolu göstereceğiz. Bu şekilde elde edilen akut hipokampal dilimler, saatlerce kayıt ta güvenilir bir şekilde sağlıklıdır ve floresan etiketli nöronların hedefalınması da dahil olmak üzere hem alan kayıtları hem de hedeflenen yama-kıskaç kayıtları için uygundur.
Introduction
Memeli akut beyin dilimi preparatları gelişiyle daha önce Aplysia gibi omurgasız preparatlar sadece mümkün olan hücresel ve sinaptik düzeyde deneyler kolaylaştırdı1. Akut hipokampal dilimlerin gelişimi özellikle önem taşıyordu, çünkü çalışan hafıza ve bağlam oluşumundan sorumlu bir yapıdır ve kolay fizyolojik manipülasyona uygun özel bir tri-sinaptik devreye sahiptir. Ancak, akut beyin dilimleri büyük çoğunluğu hala nispeten genç fare ve sıçanlar hazırlanır, sağlıklı nöronlar ve devreleri korumak daha kolay olduğu gibi, ve dilimleri uzun süre canlı kalır2,3,4. Burada, yetişkin ve yaşlanan farelerden akut hipokampal dilimlerin daha canlı olması yla sonuçlanan standart dilimleme protokollerinde değişiklikler sıyoruz.
Memeli beyin parankim uzun vadeli ex vivo canlılık için büyük engel beyin kan akışını n için decapitation aşağıdaki durur kez hızla meydana gelen ilk hipoksik hasardır. Oksijen kaybı fosfo-kreatin kaybı ile beyinde büyük enerji kaynaklarının hızlı metabolik tüketimi sonuçları (P-kreatin) en hızlı olmak, glikoz takip, adenozin trifosfat (ATP), ve glikojen4. ATP korunması beyin dilimlerinin uzun vadeli sağlığı için özel önem taşımaktadır, ATP Na-K ATPase ile membran potansiyelini korumak için gerekli olduğu gibi, ve sonuç olarak nöral aktivite5,6. Yetişkin kemirgen beyinDE ATP seviyesi ~ 2.5 mM, ve bir bazal sabit durumuna ulaşmak için 20 s içinde hızla düşer (~ 0.5 mM) etrafında 1 dk post-decapitation4,7,8. Genç hayvanlarda, ATP aynı damla gözlemlemek için daha uzun sürer (~ 2 dk); fenobarbital anestezi ile 4 dk4’edaha da yavaşlar. Bu hususlar ATP ve diğer enerji kaynaklarının kaybını önlemek için gerekli bir strateji beyin hipoksik hasarı önlemek ve sırayla uzun süreler boyunca beyin dilimlerinin sağlığını korumak için gerekli bir strateji olduğunu göstermektedir, özellikle yetişkin hayvanlarda.
Düşük sıcaklıklar metabolizmayı yavaşlatır. Sonuç olarak, mütevazı hipotermi beyin enerji rezervlerini korur gösterilmiştir: genç hayvanlarda, altı derece vücut ısısını düşüren, 37 °C’den 31 °C’ye, KONTROLLÜ hipoksi nin 4 saat üzerindeki normal seviyelerin yaklaşık %80’ine kadar ATP seviyelerini korur9. P-kreatin düzeyleri benzer şekilde korunur, yanı sıra genel fosforilasyon potansiyeli9. Bu, kafa kesmeden önce vücut ısısını düşürmenin nöroprotektif olabileceğini düşündürmektedir, çünkü normale yakın ATP seviyeleri dilim kesme ve dilim geri kazanım dönemlerinde korunabilir.
Bir ATP düşüştamamen decapitation üzerine önlenemez ölçüde, Na-K ATPase kısmen bozulmuş fonksiyonu bekleniyor, pasif sodyum akını ile depolarizasyon takip. Pasif sodyum akını hücrelere su girişi takip gibi, sitotoksik ödem ve sonunda pyknoz neden olur. Yetişkin sıçanlarda, dilim kesme çözeltilerinde Na+ iyonlarının sakaroz la değiştirilmesi sitotoksik ödemin yükünü hafifletmek için başarılı bir strateji olmuştur10,11. Daha yakın zamanda, sodyum kanal geçirgenliği azaltmak metillenmiş organik katyonlar12 sakaroz daha etkili koruma sunmak için göstermiştir, özellikle yetişkin farelerden dilimleri, N-metil-D-glukagon ile (NMDG) en yaygın farklı yaş ve beyin bölgeleri arasında uygulanabilir olan13,14,15,16.
Çok sayıda beyin dilimleme protokolleri sadece dilim kesme adımı sırasında soğuk sıcaklıklar kullanarak içerir, bazen Na+ iyon değiştirme stratejisi ile birlikte16,17. Genç hayvanlarda, beyinler kafa kesme den sonra hızlı bir şekilde ayıklanabilir çünkü kafatası hala ince ve kaldırmak kolay olduğu için yeterli nörokoruma sunmak için görünür3. Ancak, bu strateji yetişkin hayvanlardan sağlıklı dilimler üretmez. Zamanla, yetişkin kemirgenler inceleyen laboratuvarların bir dizi hayvanın vücut ısısını azaltmak için buz gibi bir çözelti ile transkardiyal perfüzyon tanıttı, ve bu nedenle beyne hipoksik hasar, önce decapitation. Bu işlem başarıyla serebellar dilimleri üretmek için uygulandı18, orta beyin dilimleri19, neokortikal dilimler11,20, perirhinal korteks21, sıçan hipokampus10,22,23, koku ampul24, ventral striatum25, görme korteks26.
Sıçan ve farelerde bazı beyin bölgelerinde dilimleri hazırlanmasında transkardiyal perfüzyon ve Na+ iyon replasmanı tarafından sunulan avantajlara rağmen, fare hipokampus hipoksi korumak için en zorlu alanlardan biri olmaya devam etmektedir13,20. Bugüne kadar, nörodejenerasyon yaşlanma fareler ve fare modelleri hipokampus dilimleme için en yaygın yaklaşımlardan biri izole hipokampi klasik hızlı dilimleme içerir27. Burada açıklanan protokolde, hayvana çapraz olarak buz gibi Na+– serbest NMDG tabanlı yapay beyin-omurilik sıvısı (NMDG-aCSF) ile transkardi olarak nüfuz ederek beyin kesiti uygulayarak yetişkin beyindeki ATP kaybını en aza indiriyoruz. Dilimler daha sonra buz gibi Na+-free NMDG-aCSF olarak kesilir. Bu gelişmiş protokol ile dilimleme den sonra 10 saate kadar sağlıklı ve uzun süreli alan kayıtları ve yama-kıskaç çalışmaları için uygun olan yetişkin ve yaşlanan farelerden akut hipokampal dilimler elde ediyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol, yetişkin ve yaşlanan farelerden elde edilen hipokampal dilimlerin kesimden sonra saatlerce sağlıklı ve canlı kalabildiğini göstermektedir. Bu protokol kullanılarak hazırlanan dilimler, yama kelepçesi kayıtlarının yanı sıra CA1 bölgelerindeuzun ömürlü alan kayıtları için uygundur.
Bu protokolde iki kritik adım vardır. İlk adım buz gibi bir çözelti ile transkardiyal perfüzyon adımıdır. Kan hızlı açıklık karaciğer renginin hızl?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Carla J. Shatz’a tavsiye ve destek için teşekkür ederim ve Dr. Barbara K. Brott ve Michelle K. Drews’a taslağı eleştirel olarak okudukları için teşekkür ederim. Çalışma NIH EY02858 ve Mathers Charitable Foundation tarafından CJS hibe desteklenir.
Materials
| “60 degree” tool | made in-house | ||
| #10 scalpel blade | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371110 | |
| 1M CaCl2 | Fluka Analytical | 21114 | |
| 95%O2/5%CO2 | Praxiar or another local supplier | ||
| Acepromazine maleate (AceproJect) | Henry Schein | 5700850 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| Beakers, measuring cylinders, reagent bottles | |||
| Brushes size 00-2 | Ted Pella | Crafts stores are another source of soft brushes, with larger selection and better quality than Ted Pella. | |
| CCD camera | Olympus | XM10 | |
| Choline bicarbonate | Pfalz & Bauer | C21240 | |
| Cyanoacrilate glue | Krazy glue | Singles | |
| Decapitation scissors | FST | 14130-17 | |
| Feather blades | Feather | FA-10 | |
| Filter paper #2 | Whatman | Either rounds or pieces cut from a bigger sheet work well. | |
| Forceps | A. Dumont & Fils | Inox 3c | |
| Glass bubblers (Robu glass borosillicate microfilter candles) – porosity 3 | Robuglas.com | 18103 or 18113 | Glass bubblers are more expensive than bubbling stones used in aquaria. However, they are easy to clean and sterilize, and can last a long time. |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | |
| Ice buckets | |||
| KCl | Sigma-Aldrich | P4504 | |
| Ketamine HCl (KetaVed) | VEDCO | NDC 50989-996-06 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | |
| Leica Tissue slicer VT1000S | The cutting settings are 1 mm horizontal blade amplitude, frequency dial at 9, and speed setting at 2 | ||
| Magnetic stirrers and stir bars | |||
| Mg2SO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | 230391 | |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | |
| MilliQ water machine | Millipore | Source for 18 Mohm water | |
| Na-ascorbate | Sigma-Aldrich | A4035 | |
| Na-pyruvate | Sigma-Aldrich | P8574 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| NaHCO3 | EMD | SX0320-1 | |
| Needle 27G1/2 | |||
| NMDG | Sigma-Aldrich | M2004 | |
| Paper tape | |||
| Peristaltic pump | Cole-Parmer | #7553-70 | |
| Peristaltic pump head | Cole-Parmer | Masterflex #7518-00 | |
| Personna blades | Personna double edge | Amazon | |
| pH meter | |||
| Recovery chamber | in-house made | ||
| Scalpel blade handle size 3 | Bard-Parker (Aspen Surgical) | 371030 | |
| Scissors angled blade | FST | 14081-09 | |
| Single edge industrial razor blade #9 | VWR | 55411 | |
| Spatulas | |||
| Transfer pipettes | Samco Scientific | 225 | |
| Upright microscope | Olympus BX51WI | ||
| Xylazine HCl (XylaMed) | VetOne | 510650 |
References
- Glanzman, D. L. The cellular mechanisms of learning in Aplysia: of blind men and elephants. Biological Bulletin. 210 (3), 271-279 (2006).
- Aitken, P. G., et al. Preparative methods for brain slices: a discussion. Journal of Neuroscince Methods. 59 (1), 139-149 (1995).
- Edwards, F. A., Konnerth, A. Patch-clamping cells in sliced tissue preparations. Methods in Enzymology. 207 (13), 208-222 (1992).
- Lowry, O. H., Passonneau, J. V., Hasselberger, F. X., Schulz, D. W. Effect of Ischemia on Known Substrates and Cofactors of the Glycolytic Pathway in Brain. Journal of Biological Chemistry. 239, 18-30 (1964).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. The effect of hypoxia on evoked potentials in the in vitro hippocampus. Journal of Physiology. 287, 427-438 (1979).
- Lipton, P., Whittingham, T. S. Reduced ATP concentration as a basis for synaptic transmission failure during hypoxia in the in vitro guinea-pig hippocampus. Journal of Physiology. 325 (1), 51-65 (1982).
- Free Mandel, P. H.S. Free nucleotides of the brain in various mammals. Journal of Neurochemistry. 8, 116-125 (1961).
- Andjus, R. K., Dzakula, Z., Markley, J. L., Macura, S. Brain energetics and tolerance to anoxia in deep hypothermia. Annals of the New York Academy of Sciences. 1048, 10-35 (2005).
- Williams, G. D., Dardzinski, B. J., Buckalew, A. R., Smith, M. B. Modest hypothermia preserves cerebral energy metabolism during hypoxia-ischemia and correlates with brain damage: a 31P nuclear magnetic resonance study in unanesthetized neonatal rats. Pediatric Research. 42 (5), 700-708 (1997).
- Gasparini, S., Losonczy, A., Chen, X., Johnston, D., Magee, J. C. Associative pairing enhances action potential back-propagation in radial oblique branches of CA1 pyramidal neurons. Journal of Physiology. 580 (3), 787-800 (2007).
- Thomson, A. M., Bannister, A. P. Release-independent depression at pyramidal inputs onto specific cell targets: dual recordings in slices of rat cortex. Journal of Physiology. 519 (1), 57-70 (1999).
- Hille, B. The permeability of the sodium channel to organic cations in myelinated nerve. Journal of General Physiology. 58 (6), 599-619 (1971).
- Ting, J., Daigle, T., Chen, Q., Feng, G., Martina, M., Taverna, S. . Patch-Clamp Methods and Protocols. 1183, 221-242 (2014).
- Jiang, X., et al. Principles of connectivity among morphologically defined cell types in adult neocortex. Science. 350 (6264), 1-10 (2015).
- Djurisic, M., Brott, B. K., Saw, N. L., Shamloo, M., Shatz, C. J. Activity-dependent modulation of hippocampal synaptic plasticity via PirB and endocannabinoids. Molecular Psychiatry. 24 (8), 1206-1219 (2019).
- Djurisic, M., et al. PirB regulates a structural substrate for cortical plasticity. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (51), 20771-20776 (2013).
- Vidal, G. S., Djurisic, M., Brown, K., Sapp, R. W., Shatz, C. J. Cell-Autonomous Regulation of Dendritic Spine Density by PirB. eNeuro. 3 (5), 1-15 (2016).
- Blot, A., Barbour, B. Ultra-rapid axon-axon ephaptic inhibition of cerebellar Purkinje cells by the pinceau. Nature Neuroscience. 17 (2), 289-295 (2014).
- Lammel, S., Ion, D. I., Roeper, J., Malenka, R. C. Projection-specific modulation of dopamine neuron synapses by aversive and rewarding stimuli. Neuron. 70 (5), 855-862 (2011).
- Ting, J. T., et al. Preparation of Acute Brain Slices Using an Optimized N-Methyl-D-glucamine Protective Recovery Method. Journal of Visual Experiments. (132), e53825 (2018).
- Moyer, J. R., Brown, T. H. Methods for whole-cell recording from visually preselected neurons of perirhinal cortex in brain slices from young and aging rats. Journal of Neuroscience Methods. 86 (1), 35-54 (1998).
- Losonczy, A., Magee, J. C. Integrative properties of radial oblique dendrites in hippocampal CA1 pyramidal neurons. Neuron. 50 (2), 291-307 (2006).
- Frick, A., Magee, J., Johnston, D. LTP is accompanied by an enhanced local excitability of pyramidal neuron dendrites. Nature Neuroscience. 7 (2), 126-135 (2004).
- Alvarado-Martinez, R., Salgado-Puga, K., Pena-Ortega, F. Amyloid beta inhibits olfactory bulb activity and the ability to smell. PLoS One. 8 (9), 75745 (2013).
- Brooks, J. M., O’Donnell, P. Kappa Opioid Receptors Mediate Heterosynaptic Suppression of Hippocampal Inputs in the Rat Ventral Striatum. Journal of Neuroscience. 37 (30), 7140-7148 (2017).
- Goel, A., Lee, H. K. Persistence of experience-induced homeostatic synaptic plasticity through adulthood in superficial layers of mouse visual cortex. Journal of Neuroscience. 27 (25), 6692-6700 (2007).
- Mathis, D. M., Furman, J. L., Norris, C. M. Preparation of acute hippocampal slices from rats and transgenic mice for the study of synaptic alterations during aging and amyloid pathology. Journal of Visual Experiments. (49), e2330 (2011).
- Izumi, Y., Zorumski, C. F. Neuroprotective effects of pyruvate following NMDA-mediated excitotoxic insults in hippocampal slices. Neuroscience Letters. 478 (3), 131-135 (2010).
- Hajos, N., Mody, I. Establishing a physiological environment for visualized in vitro brain slice recordings by increasing oxygen supply and modifying aCSF content. Journal of Neuroscience Methods. 183 (2), 107-113 (2009).
- . Hippocampus Rat Available from: https://synapseweb.clm.utexas.edu/hippocampus-rat (1999)
- Combe, C. L., Canavier, C. C., Gasparini, S. Intrinsic Mechanisms of Frequency Selectivity in the Proximal Dendrites of CA1 Pyramidal Neurons. Journal of Neuroscience. 38 (38), 8110-8127 (2018).
- Rothman, S. M. The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx. Journal of Neuroscience. 5 (6), 1483-1489 (1985).
