Indagini dettagliate sugli stadi delle zanzare dei parassiti della malaria sono fondamentali per progettare efficaci strategie di blocco della trasmissione. Questo protocollo dimostra come coltura efficacemente gametociti infettivi e quindi nutrire questi gametociti alle zanzare per generare stadi di zanzara di P. falciparum.
La malaria rimane uno dei più importanti problemi di salute pubblica, causando morbilità e mortalità significative. La malaria è una malattia trasmessa dalle zanzare trasmessa attraverso un morso infettivo dalla zanzara femmina Anopheles. Il controllo della malaria alla fine si baserà su una moltitudine di approcci, che includono modi per bloccare la trasmissione da, attraverso e dalle zanzare. Per studiare in laboratorio gli stadi delle zanzare dei parassiti della malaria, abbiamo ottimizzato un protocollo per la coltura di gametociti di Plasmodium falciparum altamente infettivi, uno stadio parassitario necessario per la trasmissione dall’ospite umano al vettore della zanzara. I gametociti di P. falciparum maturano attraverso cinque fasi morfologicamente distinte, che richiedono circa 1-2 settimane. La coltura dei gametociti descritta in questo protocollo viene completata in 15 giorni e sono infettive per le zanzare dai giorni 15-18. Questi protocolli sono stati sviluppati per mantenere un ciclo continuo di infezione dei gametociti competenti e per mantenere l’apporto ininterrotto degli stadi di zanzara del parassita. Qui, descriviamo la metodologia della coltura dei gametociti e come infettare le zanzare con questi parassiti usando alimentatori a membrana di vetro.
La malaria è causata dai parassiti Plasmodium e viene trasmessa ai loro ospiti vertebrati attraverso il morso infettivo delle zanzare Anopheles femminili. Secondo il rapporto 2019 dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), ci sono stati circa 405.000 decessi, su un totale di 228 milioni di casi di malaria1. La maggior parte dei decessi correlati alla malaria sono stati concentrati nella regione africana, specialmente tra i bambini sotto i cinque anni di età. Mentre il tasso di incidenza complessivo della malaria è diminuito a livello globale dal 2010, negli ultimi anni il declino si è stabilizzato e sono urgentemente necessarie ulteriori strategie di controllo per eliminare la malattia.
Gli stadi ciclici del sangue asessuato dei parassiti della malaria causano patogenesi della malattia e un piccolo sottoinsieme di questi si differenzia in gametociti femminili e maschili. I gametociti del Plasmodium falciparum sono unici in natura in quanto impiegano 7-10 giorni per svilupparsi attraverso cinque stadi morfologicamente distinti. I gametociti immaturi dallo stadio I al IV sono sequestrati nel parenchima del midollo osseo e rimangono in gran parte assenti dalla circolazione periferica2,3,4,5. Gli eritrociti infettati da gametociti maturi allo stadio V vengono rilasciati nel flusso sanguigno e circolano liberamente per essere assorbiti dalle zanzare. Una volta all’interno del midgut della zanzara, i gametociti vengono attivati, attraverso un cambiamento di temperatura e l’esposizione all’ambiente midgut, si trasformano in gameti femminili e maschili e iniziano lo sviluppo degli stadi di zanzara, che culmina con gli stadi infettivi degli sporozoiti nelle ghiandole salivari della zanzara6,7.
Da quando Trager e Jenson8 hanno descritto un metodo standardizzato per la coltura di P. falciparum, gli studi sugli stadi del sangue asessuato sono notevolmente progrediti. Tuttavia, la mancanza di un sistema di coltura affidabile per le fasi sessuali ha reso difficile lo studio dei gametociti di P. falciparum, della biologia della trasmissione e degli stadi delle zanzare. Negli ultimi anni sono stati pubblicati diversi metodi che hanno aiutato i laboratori a stabilire colture di gametociti9,10,11,12. Questo manoscritto descrive un protocollo standardizzato e affidabile per la coltura di gametociti di P. falciparum che può rappresentare una risorsa preziosa per la comunità di ricerca sulla malaria. Questo metodo consente la robusta produzione di gametociti maturi e infettivi che, insieme a un protocollo standardizzato di alimentazione delle zanzare, si traduce in un’infettività delle zanzare altamente affidabile. Questi metodi sono stati stabiliti per mantenere la fornitura ininterrotta di gametociti e parassiti dello stadio di zanzara. In questo manoscritto, descriviamo un protocollo di coltura dei gametociti approfondito (Figura 1), la preparazione di alimentatori a membrana di vetro e l’infezione delle zanzare usando questi alimentatori a membrana (Figura 2), la dissezione del midgut (Figura 3) e la ghiandola salivare delle zanzare (Figura 4) e la quantificazione dell’infezione nella zanzara dopo la dissezione del midgut e della ghiandola salivare.
I metodi qui descritti sono stati utilizzati con successo presso il Johns Hopkins Malaria Research Institute per più di 10 anni15,16,17,18,19,20,21,22. I gametociti prodotti utilizzando questo protocollo sono stati utilizzati per saggi gametocitocidi ad al…
The authors have nothing to disclose.
Gli autori ringraziano Bloomberg Philanthropies per il sostegno finanziario al Johns Hopkins Malaria Research Institute (JHMRI). Questo lavoro non sarebbe stato possibile senza l’esperienza fornita dalle strutture di base per insetti e parassitologia JHMRI.
10% Sugar solution | |||
10ml serological pipet | Falcon | 357551 | |
15 ml conical tube | Falcon | 352096 | |
1ml serological pipet | Falcon | 357521 | |
25 ml serological pipet | Falcon | 357535 | |
37°C Incubator | |||
50 ml conical tube | Falcon | 352070 | |
5ml serological pipet | Falcon | 357543 | |
6 well tissue culture plates | Falcon | 353046 | |
70% Ethanol | |||
9" glass pipet | Fisherbrand | 13-678-6B | |
Anopheles Mosquitoes | JHMRI, Insectary core | We use A. stephensi or A. gambiae (keele) | |
cell counter | |||
Circulating water bath | |||
fine tip forceps | Fisherbrand | 12-000-122 | |
Geimsa stain | Sigma | GS1L | |
Glass desiccator | |||
Glass membrane feeder | Chemglass Life Sciences | CG183570 | |
Glass slides | Fisherbrand | 12-552-3 | |
HBSS | Sigma | H6648 | |
Human Blood O+ | JHU | Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit | |
Human Serum O+ | Interstate blood bank | Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C. | |
Hypoxanthine | Sigma | H9337 | Make 500x stock in 1M NaOH |
Mercurochrome | Sigma | M7011 | Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed |
Micro Pipette | |||
Microscope | Olympus | Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work. | |
Mosquito cups | Neptune cups | ||
N-acetylglucosamine | Sigma | A3286 | Optional and needed only when pure gametocytes are required. |
Netting | Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding | ||
Parafilm | |||
PBS | |||
Petri dish | Thermo Scientific | 249964 | |
Pipet tips | |||
Pipetman | |||
Plasmodium falciparum NF54 | BEI Resources | MRA-1000 | Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply |
RPMI 1640 | Corning | CV-041-CV | Media contains glutamine and HEPES |
Slide warmer | |||
Sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation |
water bath | |||
Xanthurenic Acid | Sigma | D120804 | For flagellation media |