Plasmodium falciparum Coltura di gametociti e infezione da zanzare attraverso l'alimentazione artificiale della membrana

Summary

Indagini dettagliate sugli stadi delle zanzare dei parassiti della malaria sono fondamentali per progettare efficaci strategie di blocco della trasmissione. Questo protocollo dimostra come coltura efficacemente gametociti infettivi e quindi nutrire questi gametociti alle zanzare per generare stadi di zanzara di P. falciparum.

Abstract

La malaria rimane uno dei più importanti problemi di salute pubblica, causando morbilità e mortalità significative. La malaria è una malattia trasmessa dalle zanzare trasmessa attraverso un morso infettivo dalla zanzara femmina Anopheles. Il controllo della malaria alla fine si baserà su una moltitudine di approcci, che includono modi per bloccare la trasmissione da, attraverso e dalle zanzare. Per studiare in laboratorio gli stadi delle zanzare dei parassiti della malaria, abbiamo ottimizzato un protocollo per la coltura di gametociti di Plasmodium falciparum altamente infettivi, uno stadio parassitario necessario per la trasmissione dall’ospite umano al vettore della zanzara. I gametociti di P. falciparum maturano attraverso cinque fasi morfologicamente distinte, che richiedono circa 1-2 settimane. La coltura dei gametociti descritta in questo protocollo viene completata in 15 giorni e sono infettive per le zanzare dai giorni 15-18. Questi protocolli sono stati sviluppati per mantenere un ciclo continuo di infezione dei gametociti competenti e per mantenere l’apporto ininterrotto degli stadi di zanzara del parassita. Qui, descriviamo la metodologia della coltura dei gametociti e come infettare le zanzare con questi parassiti usando alimentatori a membrana di vetro.

Introduction

La malaria è causata dai parassiti Plasmodium e viene trasmessa ai loro ospiti vertebrati attraverso il morso infettivo delle zanzare Anopheles femminili. Secondo il rapporto 2019 dell’Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), ci sono stati circa 405.000 decessi, su un totale di 228 milioni di casi di malaria¹. La maggior parte dei decessi correlati alla malaria sono stati concentrati nella regione africana, specialmente tra i bambini sotto i cinque anni di età. Mentre il tasso di incidenza complessivo della malaria è diminuito a livello globale dal 2010, negli ultimi anni il declino si è stabilizzato e sono urgentemente necessarie ulteriori strategie di controllo per eliminare la malattia.

Gli stadi ciclici del sangue asessuato dei parassiti della malaria causano patogenesi della malattia e un piccolo sottoinsieme di questi si differenzia in gametociti femminili e maschili. I gametociti del Plasmodium falciparum sono unici in natura in quanto impiegano 7-10 giorni per svilupparsi attraverso cinque stadi morfologicamente distinti. I gametociti immaturi dallo stadio I al IV sono sequestrati nel parenchima del midollo osseo e rimangono in gran parte assenti dalla circolazione periferica^2,3,4,5. Gli eritrociti infettati da gametociti maturi allo stadio V vengono rilasciati nel flusso sanguigno e circolano liberamente per essere assorbiti dalle zanzare. Una volta all’interno del midgut della zanzara, i gametociti vengono attivati, attraverso un cambiamento di temperatura e l’esposizione all’ambiente midgut, si trasformano in gameti femminili e maschili e iniziano lo sviluppo degli stadi di zanzara, che culmina con gli stadi infettivi degli sporozoiti nelle ghiandole salivari della zanzara^6,7.

Da quando Trager e Jenson⁸ hanno descritto un metodo standardizzato per la coltura di P. falciparum, gli studi sugli stadi del sangue asessuato sono notevolmente progrediti. Tuttavia, la mancanza di un sistema di coltura affidabile per le fasi sessuali ha reso difficile lo studio dei gametociti di P. falciparum, della biologia della trasmissione e degli stadi delle zanzare. Negli ultimi anni sono stati pubblicati diversi metodi che hanno aiutato i laboratori a stabilire colture di gametociti^9,10,11,12. Questo manoscritto descrive un protocollo standardizzato e affidabile per la coltura di gametociti di P. falciparum che può rappresentare una risorsa preziosa per la comunità di ricerca sulla malaria. Questo metodo consente la robusta produzione di gametociti maturi e infettivi che, insieme a un protocollo standardizzato di alimentazione delle zanzare, si traduce in un’infettività delle zanzare altamente affidabile. Questi metodi sono stati stabiliti per mantenere la fornitura ininterrotta di gametociti e parassiti dello stadio di zanzara. In questo manoscritto, descriviamo un protocollo di coltura dei gametociti approfondito (Figura 1), la preparazione di alimentatori a membrana di vetro e l’infezione delle zanzare usando questi alimentatori a membrana (Figura 2), la dissezione del midgut (Figura 3) e la ghiandola salivare delle zanzare (Figura 4) e la quantificazione dell’infezione nella zanzara dopo la dissezione del midgut e della ghiandola salivare.

Protocol

Le raccolte di sangue descritte di seguito sono state approvate dall’Institutional Review Board della Johns Hopkins University. P. falciparum viene coltivato in globuli rossi freschi in condizioni sterili in un impianto di livello di biosicurezza 2 (BSL2) e si usa cautela per maneggiare materiali biologici. Dopo ogni passaggio che coinvolge sangue o prodotti sanguigni, ogni stoviglie o bicchieri viene risciacquato con candeggina al 10% all’interno del cappuccio prima del corretto smaltimento. <p class="jove_…

Representative Results

Qui presentiamo i risultati di una serie di alimentazioni a membrana utilizzando colture di gametociti P. falciparum NF54 generate utilizzando il protocollo sopra (vedi (Figura 5). La coltura dei gametociti è stata iniziata con circa lo 0,5% di coltura asessuata a stadio misto il giorno 0, che è cresciuta fino a un picco di parassitemia di circa il 15% entro il giorno 4 e il giorno 5. Come mostrato nella Figura 5A a questa alta parassitemia, i parassi…

Discussion

I metodi qui descritti sono stati utilizzati con successo presso il Johns Hopkins Malaria Research Institute per più di 10 anni^{15,16,17,18,19,20,21,22.} I gametociti prodotti utilizzando questo protocollo sono stati utilizzati per saggi gametocitocidi ad al…

Materials

10% Sugar solution
10ml serological pipet	Falcon	357551
15 ml conical tube	Falcon	352096
1ml serological pipet	Falcon	357521
25 ml serological pipet	Falcon	357535
37°C Incubator
50 ml conical tube	Falcon	352070
5ml serological pipet	Falcon	357543
6 well tissue culture plates	Falcon	353046
70% Ethanol
9" glass pipet	Fisherbrand	13-678-6B
Anopheles Mosquitoes	JHMRI, Insectary core		We use A. stephensi or A. gambiae (keele)
cell counter
Circulating water bath
fine tip forceps	Fisherbrand	12-000-122
Geimsa stain	Sigma	GS1L
Glass desiccator
Glass membrane feeder	Chemglass Life Sciences	CG183570
Glass slides	Fisherbrand	12-552-3
HBSS	Sigma	H6648
Human Blood O+	JHU		Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit
Human Serum O+	Interstate blood bank		Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C.
Hypoxanthine	Sigma	H9337	Make 500x stock in 1M NaOH
Mercurochrome	Sigma	M7011	Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed
Micro Pipette
Microscope	Olympus		Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work.
Mosquito cups	Neptune cups
N-acetylglucosamine	Sigma	A3286	Optional and needed only when pure gametocytes are required.
Netting			Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding
Parafilm
PBS
Petri dish	Thermo Scientific	249964
Pipet tips
Pipetman
Plasmodium falciparum NF54	BEI Resources	MRA-1000	Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply
RPMI 1640	Corning	CV-041-CV	Media contains glutamine and HEPES
Slide warmer
Sodium bicarbonate	Sigma	S6297	Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation
water bath
Xanthurenic Acid	Sigma	D120804	For flagellation media