Plasmodium falciparum Cultura gametocito e infecção por mosquitos através da alimentação artificial

Summary

Investigações detalhadas sobre os estágios dos mosquitos dos parasitas da malária são fundamentais para projetar estratégias eficazes de bloqueio de transmissão. Este protocolo demonstra como efetivamente cultivar gametocitos infecciosos e, em seguida, alimentar esses gametocitos para mosquitos para gerar estágios de mosquitos de P. falciparum.

Abstract

A malária continua sendo um dos mais importantes problemas de saúde pública, causando morbidade e mortalidade significativas. A malária é uma doença transmitida por mosquitos transmitida através de uma picada infecciosa do mosquito Anopheles fêmea. O controle da malária eventualmente dependerá de uma infinidade de abordagens, o que inclui maneiras de bloquear a transmissão para, através e de mosquitos. Para estudar os estágios dos mosquitos dos parasitas da malária em laboratório, otimizamos um protocolo para cultivar gametocitos plasmodium falciparum altamente infecciosos, um estágio parasita necessário para a transmissão do hospedeiro humano para o mosquito vetor. P. falciparum gametocitos amadurecem através de cinco passos morfologicamente distintos, que leva aproximadamente 1-2 semanas. A cultura gametócica descrita neste protocolo é concluída em 15 dias e são infecciosas para mosquitos dos dias 15 a 18. Esses protocolos foram desenvolvidos para manter um ciclo contínuo de gametocitos competentes para infecção e para manter o fornecimento ininterrupto de estágios do mosquito do parasita. Aqui, descrevemos a metodologia da cultura gametocito e como infectar mosquitos com esses parasitas usando alimentadores de membrana de vidro.

Introduction

A malária é causada por parasitas de Plasmodium e é transmitida aos seus hospedeiros vertebrados através de picadas infecciosas de mosquitos Anopheles fêmeas. De acordo com o relatório da Organização Mundial da Saúde (OMS) de 2019, foram estimadas 405 mil mortes, de um total de 228 milhões de casos de malária¹. A maioria dos óbitos relacionados à malária estava concentrada na região africana, especialmente entre crianças menores de cinco anos de idade. Embora a taxa global de incidência de malária tenha diminuído globalmente a partir de 2010, nos últimos anos o declínio aumentou e estratégias adicionais de controle são urgentemente necessárias para eliminar a doença.

Os estágios sanguíneos assexuados cíclicos de parasitas da malária causam patogênese da doença e um pequeno subconjunto destes diferenciam-se em gametocitos femininos e masculinos. Os gametocitos plasmodium falciparum são únicos na natureza, pois levam de 7 a 10 dias para se desenvolverem através de cinco estágios morfologicamente distintos. Gametócitos imaturos da fase I a IV são sequestrados em parenchyma de medula óssea e permanecem em grande parte ausentes da circulação periférica^2,3,4,5. Os eritrócitos infectados com gametócitos maduros do estágio V são liberados na corrente sanguínea e circulam livremente para serem tomados por mosquitos. Uma vez dentro do mosquito midgut, os gametócitos são ativados, através de uma mudança de temperatura e exposição ao ambiente midgut, transformam-se em gametas femininos e masculinos e iniciam o desenvolvimento dos estágios do mosquito, que culmina com os estágios infecciosos dos esporozoitas nas glândulas salivares do mosquito^6,7.

Desde que Trager e Jenson⁸ descreveram um método padronizado para cultivar P. falciparum,os estudos sobre os estágios sanguíneos assexuados têm avançado muito. No entanto, a falta de um sistema de cultura confiável para estágios sexuais tem dificultado o estudo de gametocitos de P. falciparum, biologia de transmissão e estágios de mosquitos. Nos últimos anos, foram publicados diversos métodos que têm auxiliado laboratórios no estabelecimento de culturas gametócitos^9,10,11,12. Este manuscrito descreve um protocolo padronizado e confiável para cultivar gametocitos P. falciparum que podem representar um recurso valioso para a comunidade de pesquisa da malária. Este método permite a produção robusta de gametocitos maduros e infecciosos que, juntamente com um protocolo padronizado de alimentação de mosquitos, resulta em infectividade de mosquitos altamente confiável. Esses métodos foram estabelecidos para manter o fornecimento ininterrupto de gametócitos e parasitas em estágio de mosquitos. Neste manuscrito, descrevemos um protocolo de cultura gametocito completo(Figura 1),preparação de alimentadores de membrana de vidro e infecção de mosquitos utilizando esses alimentadores de membrana(Figura 2),dissecção de midgut(Figura 3) e glândula salivar de mosquitos(Figura 4), e quantificação de infecção em mosquito após dissecação de glândulas médias e salivares.

Protocol

As coleções de sangue descritas abaixo foram aprovadas pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade Johns Hopkins. P. falciparum é cultivado em RBCs frescos em condições estéreis em uma instalação de biossegurança nível 2 (BSL2) e a cautela é usada para lidar com materiais biológicos. Após cada passo envolvendo sangue ou produtos sanguíneos, cada plástico ou vidro é enxaguado com alvejante 10% dentro do capô antes do descarte adequado. 1. Reagentes e prepara?…

Representative Results

Aqui apresentamos resultados de uma série de rações de membrana utilizando culturas de gametocitte P. falciparum NF54 geradas usando o protocolo acima (ver (Figura 5). A cultura gametocito foi iniciada com aproximadamente 0,5% de cultura assexuada de palco misto no dia 0, que cresceu para um pico de parasitamia de aproximadamente 15% no dia 4 e dia 5. Como mostrado na Figura 5A nesta alta parasitamia, os parasitas estão estressados e a cultura de es…

Discussion

Os métodos aqui descritos têm sido utilizados com sucesso no Johns Hopkins Malaria Research Institute por mais de 10 anos^{15,16,17,18,19,20,21,22}. Os gametócitos produzidos usando este protocolo têm sido usados para ensaios gametocitopecidas de alto rend…

Materials

10% Sugar solution
10ml serological pipet	Falcon	357551
15 ml conical tube	Falcon	352096
1ml serological pipet	Falcon	357521
25 ml serological pipet	Falcon	357535
37°C Incubator
50 ml conical tube	Falcon	352070
5ml serological pipet	Falcon	357543
6 well tissue culture plates	Falcon	353046
70% Ethanol
9" glass pipet	Fisherbrand	13-678-6B
Anopheles Mosquitoes	JHMRI, Insectary core		We use A. stephensi or A. gambiae (keele)
cell counter
Circulating water bath
fine tip forceps	Fisherbrand	12-000-122
Geimsa stain	Sigma	GS1L
Glass desiccator
Glass membrane feeder	Chemglass Life Sciences	CG183570
Glass slides	Fisherbrand	12-552-3
HBSS	Sigma	H6648
Human Blood O+	JHU		Wash RBCs three times with RPMI and refrigerate at 50% heamatocrit
Human Serum O+	Interstate blood bank		Pool at-least 6 units of serum from different donors and freeze down aliquots at -20°C.
Hypoxanthine	Sigma	H9337	Make 500x stock in 1M NaOH
Mercurochrome	Sigma	M7011	Prepare 1% stock solution in PBS that can be diluted to 0.1% when needed
Micro Pipette
Microscope	Olympus		Any microscope with 10x, 40x and 100x objective will work.
Mosquito cups	Neptune cups
N-acetylglucosamine	Sigma	A3286	Optional and needed only when pure gametocytes are required.
Netting			Make sure it can contain mosquitoes and allow blood feeding
Parafilm
PBS
Petri dish	Thermo Scientific	249964
Pipet tips
Pipetman
Plasmodium falciparum NF54	BEI Resources	MRA-1000	Freeze down large numbers of early passage culture to make sure you have a constant supply
RPMI 1640	Corning	CV-041-CV	Media contains glutamine and HEPES
Slide warmer
Sodium bicarbonate	Sigma	S6297	Optional for media, add only when using malaria gas mix during culture incubation
water bath
Xanthurenic Acid	Sigma	D120804	For flagellation media