Opnåelse humane mikroglia fra voksent humant hjernevæv
Summary
Denne protokol er en effektiv, omkostningseffektiv og robust metode til isolering af primære mikroglia fra levende, voksne, menneskelige hjernevæv. Isolerede primære menneskelige mikroglia kan tjene som et redskab til at studere cellulære processer i homøostase og sygdom.
Abstract
Mikroglia er hjemmehørende medfødte immunceller i centralnervesystemet (CNS). Microglia spiller en afgørende rolle under udviklingen, i at opretholde homøostase, og under infektion eller skade. Flere uafhængige forskningsgrupper har fremhævet den centrale rolle, som mikroglia spiller i autoimmune sygdomme, autoinflammatoriske syndromer og kræft. Aktivering af mikroglia i nogle neurologiske sygdomme kan direkte deltage i patogene processer. Primær mikroglia er et effektivt redskab til at forstå immunrespons i hjernen, celle-celle interaktioner og dysregulated mikroglia fænotyper i sygdom. Primære mikroglia efterligne in vivo mikrogliale egenskaber bedre end udødeliggjorte mikrogliale cellelinjer. Human voksen mikroglia udviser forskellige egenskaber i forhold til menneskelige føtal og gnaver mikroglia. Denne protokol giver en effektiv metode til isolering af primære mikroglia fra voksne menneskelige hjerne. Undersøgelse af disse mikroglia kan give kritisk indsigt i celle-celle interaktioner mellem mikroglia og andre hjemmehørende cellulære populationer i CNS, herunder oligodendrocytter, neuroner og astrocytter. Derudover kan mikroglia fra forskellige menneskelige hjerner dyrkes til karakterisering af unikke immunresponser for personlig medicin og et utal af terapeutiske anvendelser.
Introduction
Centralnervesystemet (CNS) er konstrueret af et komplekst netværk af neuroner og gliaceller1. Blandt gliacellerne fungerer mikroglia som de medfødte immunceller i CNS2,3. Mikroglia er ansvarlige for at opretholde homøostase i den sunde CNS4. Microglia spiller også en vigtig rolle i neuroudvikling, ved beskæring synapser2. Mikroglia er centrale for patofysiologi af flere neurologiske sygdomme, herunder men ikke begrænset til; Alzheimers sygdom5, Parkinsons sygdom6, slagtilfælde7, multipel sklerose8, traumatisk hjerneskade9, neuropatisksmerte 10,rygmarvsskade11 og hjernetumorer såsom gliomer12.
Undersøgelser i forbindelse med CNS homøostase og sygdomme udnytter gnavere mikroglia på grund af en mangel på omkostningseffektive og tidseffektive menneskelige primære mikroglia isolation protokoller13. Gnavere mikroglia ligne primære humane mikroglia i udtryk for gener som Iba-1, PU.1, DAP12 og M-CSF receptor og har været effektive i forståelsen af normale såvel som syge hjerne13. Interessant, udtrykket af flere immun-relaterede gener såsom TLR4, MHC II, Siglec-11 og Siglec-3 varierer mellem menneskelige og gnaver mikroglia13. Ekspressionen af flere gener varierer også i tidsmæssigt udtryk og i neurodegenerative sygdomme hos begge art14,15. Disse betydelige forskelle gør humane mikroglia en væsentlig model til at studere mikroglia funktion i homøostase og sygdom. Primær human mikroglia kan også være et effektivt redskab til præklinisk screening af potentielle lægemiddelkandidater16. Ovennævnte årsager understreger det stigende behov for omkostningseffektive protokoller for isolering af primære humane mikroglia.
Vi har udviklet en protokol for isolering af primære menneskelige mikroglia fra voksne humane hjernevæv indsamlet som følge af kirurgisk vindue skabt til tumor resektion eller andre kirurgiske resektioner. Metoden her er væsentligt forskellig fra de eksisterende metoder. Vi var i stand til at isolere og kultur mikroglia efter en transit tid på omkring 75 minutter fra væv indsamling site til at starte isolation protokol i laboratoriet. Vi har brugt supernatant af L929 fibroblast celler til at fremme væksten af isolerede mikroglia. Denne metode fokuserer specifikt på kultur og udvikling af kun primære mikroglia. Den resulterende kultur forberedt er omkring 80% mikroglia. Mens andre protokoller giver en beriget kultur af mikroglia ved tæthed gradient centrifugering, flow cytometri og magnetiske perler, protokollen er en hurtig, enkel, robust og omkostningseffektiv måde at kultur primære menneskelige mikroglia17,18,19,20. Evnen til at udnytte kirurgisk fjernet levende voksen hjernevæv i stedet for faste hjernevæv fra kadavere viser en ekstra fordel ved denne metode i modsætning tileksisterende procedurer 18,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mikroglia sikre homøostase i den normale hjerne og spille centrale roller i patofysiologi af forskellige neurologiske sygdomme4. Mikroglia er centrale for neuroudvikling og dannelse af synapser2. Mikrogliale undersøgelser har vist sig afgørende for at forstå udviklingen og udviklingen af forskellige neurologiske sygdomme4. Gnavere mikroglia er den fremherskende model for valg for primære mikrogliale undersøgelser, selv om gnaver mikroglia er fo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SJ’s laboratorium blev etableret med institutionelle tilskud fra IITJ og finansieres af tilskud fra Department of Biotechnology (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) og Ministeriet for Elektronik og Informationsteknologi regering i Indien (Nr. 4(16)/2019-ITEA). Den menneskelige hjernevæv sektioner blev opnået fra All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur efter institutionelle etiske komité clearance. Vi takker Mayank Rathor, B.Tech Student medlem af Design and Arts Society IIT Jodhpur, for videography støtte.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia – more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
- Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer’s disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
- Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson’s disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).
- Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
- Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
- Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer’s Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
- Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer’s disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
- Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).
- Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
- Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
- Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).
- Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
- Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).
