Het verkrijgen van Human Microglia uit volwassen menselijke hersenweefsel
Summary
Dit protocol is een efficiënte, kosteneffectieve en robuuste methode voor het isoleren van primaire microglia van levend, volwassen, menselijk hersenweefsel. Geïsoleerde primaire menselijke microglia kan dienen als een instrument voor het bestuderen van cellulaire processen in homeostase en ziekte.
Abstract
Microglia zijn ingezeten ingeboren immuuncellen van het centrale zenuwstelsel (CNS). Microglia spelen een cruciale rol tijdens de ontwikkeling, bij het handhaven van homeostase, en tijdens infectie of letsel. Verschillende onafhankelijke onderzoeksgroepen hebben gewezen op de centrale rol die microglia spelen in auto-immuunziekten, auto-inflammatoire syndromen en kanker. De activering van microglia bij sommige neurologische ziekten kan direct deelnemen aan pathogene processen. Primaire microglia zijn een krachtig hulpmiddel om de immuunreacties in de hersenen, celcelinteracties en geantreguleerde microglia fenotypes bij ziekte te begrijpen. Primaire microglia bootsen in vivo microgliale eigenschappen beter na dan vereeuwigde microgliale cellijnen. Menselijke volwassen microglia vertonen verschillende eigenschappen in vergelijking met menselijke foetale en knaagdier microglia. Dit protocol biedt een efficiënte methode voor isolatie van primaire microglia van volwassen menselijke hersenen. Het bestuderen van deze microglia kan kritische inzichten bieden in celcelinteracties tussen microglia en andere ingezeten cellulaire populaties in het CNS, waaronder oligodendrocyten, neuronen en astrocyten. Bovendien, microglia uit verschillende menselijke hersenen kan worden gekweekt voor karakterisering van unieke immuunreacties voor gepersonaliseerde geneeskunde en een groot aantal therapeutische toepassingen.
Introduction
Het centrale zenuwstelsel (CNS) is opgebouwd uit een complex netwerk van neuronen en gliacellen1. Onder de gliacellen functioneert microglia als de aangeboren immuuncellen van het CNS2,3. Microglia is verantwoordelijk voor het behoud van homeostase in het gezonde CNS4. Microglia spelen ook een belangrijke rol in de neuroontwikkeling, door het snoeien van synapsen2. Microglia staan centraal in de pathofysiologie van verschillende neurologische aandoeningen, waaronder maar niet beperkt tot; De ziekte van Alzheimer5, De ziekte van Parkinson6, beroerte7,multiple sclerose8, traumatisch hersenletsel9, neuropathische pijn10, dwarslaesie11 en hersentumoren zoals gliomen12.
Studies met betrekking tot CNS homeostase en ziekten maken gebruik van knaagdier microglia als gevolg van een gebrek aan kostenefficiënte en tijdefficiënte menselijke primaire microglia isolatie protocollen13. Knaagdier microglia lijken op primaire menselijke microglia in expressie van genen zoals Iba-1, PU.1, DAP12 en M-CSF receptor en zijn effectief geweest in het begrijpen van normale en zieke hersenen13. Interessant is dat de expressie van verschillende immuungerelateerde genen zoals TLR4, MHC II, Siglec-11 en Siglec-3 varieert tussen menselijke en knaagdiermicroglia13. De expressie van verschillende genen varieert ook in temporele expressie en in neurodegeneratieve ziekten bij beide soorten14,15. Deze significante verschillen maken menselijke microglia een essentieel model om microgliafunctie in homeostase en ziekte te bestuderen. Primaire menselijke microglia kan ook een effectief instrument voor preklinische screening van potentiële kandidaat-geneesmiddelen16. De bovengenoemde redenen onderstrepen de groeiende behoefte aan kosteneffectieve protocollen voor isolatie van primaire menselijke microglia.
We hebben een protocol ontwikkeld voor isolatie van primaire menselijke microglia van volwassen menselijk hersenweefsel verzameld als gevolg van chirurgisch venster gemaakt voor tumorresecties of andere chirurgische resecties. De methode hier is aanzienlijk anders dan bestaande methoden. We waren in staat om te isoleren en cultuur microglia na een transittijd van ongeveer 75 minuten van de weefsel collectie site te starten van de isolatie protocol in het laboratorium. We hebben de supernatant van L929 fibroblastcellen gebruikt om de groei van geïsoleerde microglia te bevorderen. Deze methode richt zich specifiek op de cultuur en ontwikkeling van alleen primaire microglia. De resulterende cultuur voorbereid is ongeveer 80% microglia. Terwijl andere protocollen zorgen voor een verrijkte cultuur van microglia door dichtheidgradiëntcentrifugatie, stroomcytometrie en magnetische kralen, is het protocol een snelle, eenvoudige, robuuste en kosteneffectieve manier om primaire menselijke microglia17,18,,19,20te verkreeden ., De mogelijkheid om chirurgisch verwijderd levend volwassen hersenweefsel te gebruiken in plaats van vaste hersenweefsels van kadavers bewijst een extra voordeel van deze methode in tegenstelling tot de bestaande procedures18,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia zorgen voor homeostase in de normale hersenen en spelen een centrale rol in de pathofysiologie van verschillende neurologische ziekten4. Microglia staan centraal in de neuroontwikkeling en vorming van synapsen2. Microgliale studies hebben bewezen cruciaal te zijn in het begrijpen van de ontwikkeling en progressie van diverse neurologische ziekten4. Knaagdier microglia zijn de heersende model van keuze voor primaire microglia studies, hoewel…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het laboratorium van SJ is opgericht met institutionele subsidies van IITJ en wordt gefinancierd door subsidies van het Department of Biotechnology (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) en de regering van het Ministerie van Elektronica en Informatietechnologie van India (nr.4(16)/2019-ITEA). De menselijke hersenen weefsel secties werden verkregen van het All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur na institutionele ethiek commissie goedkeuring. Wij danken Mayank Rathor, B.Tech Student lid van Design and Arts Society IIT Jodhpur, voor videografie ondersteuning.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia – more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
- Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer’s disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
- Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson’s disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).
- Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
- Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
- Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer’s Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
- Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer’s disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
- Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).
- Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
- Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
- Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).
- Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
- Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).
