קבלת מיקרוליה אנושית רקמת מוח אנושית בוגרת
Summary
פרוטוקול זה הוא שיטה יעילה, חסכונית וחזקה של בידוד microglia ראשוני מלחיות, מבוגר, רקמת מוח אנושית. microglia אנושי ראשוני מבודד יכול לשמש ככלי לחקר תהליכים תאיים בהונואוסטזיס ומחלות.
Abstract
Microglia הם תאים חיסוניים מולדים תושב של מערכת העצבים המרכזית (CNS). Microglia לשחק תפקיד קריטי במהלך הפיתוח, בשמירה על הומוסטאזיס, ובמהלך זיהום או פציעה. מספר קבוצות מחקר עצמאיות הדגישו את התפקיד המרכזי כי microglia לשחק במחלות אוטואימוניות, תסמונות דלקת אוטואיציה וסרטן. ההפעלה של microglia במחלות נוירולוגיות מסוימות עשויה להשתתף ישירות בתהליכים פתוגנים. microglia העיקרי הם כלי רב עוצמה כדי להבין את התגובות החיסוניות במוח, אינטראקציות תא ופנוטיפים microglia dysregulated במחלה. microglia העיקרי לחקות תכונות microglial vivo טוב יותר מאשר קווי תא microglial מונצחים. מיקרוליה למבוגרים אנושיים להפגין תכונות נפרדות לעומת מיקרוליה העובר והכורסמים האנושיים. פרוטוקול זה מספק שיטה יעילה לבידוד של microglia ראשוני ממוח אנושי בוגר. לימוד microglia אלה יכול לספק תובנות קריטיות על אינטראקציות תא בין microglia ואוכלוסיות תאים תושבים אחרים ב-CNS כולל, oligodendrocytes, נוירונים ואסטרוציטים. בנוסף, microglia ממוחות אנושיים שונים עשוי להיות מתורבת לאפיון של תגובות חיסוניות ייחודיות לרפואה מותאמת אישית ואינספור יישומים טיפוליים.
Introduction
מערכת העצבים המרכזית (CNS) בנויה של רשת מורכבת של נוירונים ותאי גליה1. בין תאי גליה, microglia לתפקד כמו התאים החיסוניים המולדים של CNS2,,3. Microglia אחראים לשמירה על הונואוסטזיס ב CNSבריא 4. Microglia גם לשחק תפקיד חשוב בהתפתחות עצבית, על ידי גיזום סינאפסות2. Microglia הם מרכזיים הפתופיזיולוגיה של מספר מחלות נוירולוגיות כולל אך לא מוגבל; מחלתאלצהיימר 5, מחלת פרקינסון6,שבץ 7, טרשת נפוצה8, פגיעה מוחיתטראומטית 9, כאבנוירופתי 10,פגיעה בחוט השדרה 11 ותגידולים במוח כגון גליומס12.
מחקרים הקשורים הומוסטאזיס CNS ומחלות לנצל microglia מכרסמים בשל דקט של עלות יעילה ויעילה בזמן אנושי ראשי microglia פרוטוקוליםבידוד 13. מיקרוליה מכרסמים דומים microglia האנושי העיקרי בביטוי של גנים כגון Iba-1, PU.1, DAP12 ו M-CSF קולטן היו יעילים בהבנת נורמלי, כמוגם מוח מחלה 13. מעניין, הביטוי של מספר גנים הקשורים למערכת החיסון כגון TLR4, MHC II, Siglec-11 ו Siglec-3 משתנה בין מיקרוליהאדם מכרסמים 13. הביטוי של מספר גנים משתנה גם בביטוי זמני ובמחלות ניווניות בשני המינים14,15. הבדלים משמעותיים אלה הופכים את המיקרוליה האנושית למודל חיוני לחקר תפקוד מיקרוליה בהומטזיס ובמחלות. microglia האנושי העיקרי יכול להיות גם כלי יעיל עבור הקרנה פרה-סרטנית של מועמדים פוטנציאליים לסמים16. הסיבות שהוזכרו לעיל מדגישות את הצורך הגובר בפרוטוקולים חסכוניים לבידוד של מיקרוליה אנושית ראשית.
פיתחנו פרוטוקול לבידוד של microglia אנושי ראשוני מרקמות מוח אנושיות בוגר שנאספו כתוצאה של חלון כירורגי שנוצר עבור ניתוחים או ניתוחים אחרים. השיטה כאן שונה במידה ניכרת מהשיטות הקיימות. הצלחנו לבודד ולתרבות מיקרוליה לאחר זמן מעבר של כ-75 דקות מאתר איסוף הרקמות כדי להתחיל את פרוטוקול הבידוד במעבדה. השתמשנו supernatant של L929 פיברובלסט תאים כדי לקדם את הצמיחה של microglia מבודד. שיטה זו מתמקדת במיוחד בתרבות ופיתוח של מיקרוליה ראשונית בלבד. התרבות שנוצרה מוכנה היא כ 80% microglia. בעוד פרוטוקולים אחרים מספקים תרבות מועשרת של microglia על ידי צנטריפוגציה הדרגתית צפיפות, ציתום זרימה חרוזים מגנטיים, הפרוטוקול הוא מהיר, פשוט, חזק וחסכוני דרך לתרבות microgliaאדם העיקרי 17,18,19,20. היכולת לנצל בניתוח הוסר רקמת מוח מבוגר חי במקום רקמות מוח קבועות של גופות מוכיח יתרון נוסף של שיטה זו בניגוד הליכיםקיימים 18,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia להבטיח הומוסטאזיס במוח הרגיל ולשחק תפקידים מרכזיים בפתופיזיולוגיה של מחלות נוירולוגיות שונות4. Microglia הם מרכזיים נוירו-פיתוח היווצרות של סינופסות2. מחקרים Microglial הוכיחו מרכזי בהבנת הפיתוח וההתקדמות של מחלות נוירולוגיות מגוונות4. מיקרוליה מכרסמ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המעבדה של SJ הוקמה עם מענקים מוסדיים מ-IITJ ומומנה על ידי מענקים מהמחלקה לביוטכנולוגיה (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) ומשרד האלקטרוניקה וטכנולוגיה של הודו (מס’ 4(16)/2019-ITEA). סעיפים רקמת המוח האנושי הושגו מכל הודו המכון למדעי הרפואה (AIIMS) ג’ודפור לאחר אישור ועדת האתיקה המוסדית. אנו מודים למאיאנק ראתור, סטודנט B.Tech של האגודה לעיצוב ואמנויות IIT ג’ודפור, על תמיכת הווידאוגרפיה.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia – more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
- Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer’s disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
- Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson’s disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).
- Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
- Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
- Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer’s Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
- Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer’s disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
- Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).
- Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
- Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
- Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).
- Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
- Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).
