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방법 논문

성인 인간 뇌 조직에서 인간 마이크로글리아 획득

7.4K 조회수

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DOI:

10.3791/61438

⸱

2020년 8월 30일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Bioscience and Bioengineering, Indian Institute of Technology Jodhpur, 2Department of Neurosurgery, All India Institute of Medical Sciences Jodhpur

교신 저자: Sushmita Jha <sushmitajha@gmail.com>

이 논문에서

요약

이 프로토콜은 살아있는, 성인, 인간의 뇌 조직에서 기본 microglia를 격리하는 효율적이고 비용 효율적이며 강력한 방법입니다. 고립 된 1 차적인 인간 microglia는 항상성 및 질병에 있는 세포 프로세스를 공부하기 위한 공구역할을 할 수 있습니다.

초록

Microglia는 중추 신경계 (CNS)의 거주자 타고난 면역 세포입니다. Microglia는 개발 중, 항상성을 유지 하며 감염 또는 부상 중에 중요한 역할을 합니다. 몇몇 독립적인 연구 단은 microglia가 자기 면역 질병, 자가 염증성 증후군 및 암에서 재생하는 중앙 역할을 강조했습니다. 몇몇 신경학상 질병에 있는 microglia의 활성화는 병원성 프로세스에 직접 참여할 수 있습니다. 1 차적인 microglia는 두뇌에 있는 면역 반응을 이해하는 강력한 공구입니다, 세포 세포 상호 작용 및 질병에 있는 dysregulated microglia 표현형. 1 차적인 microglia는 불멸한 microglial 세포주 보다는 더 나은 생체 내 microglial 속성에서 모방합니다. 인간 성인 microglia 인간의 태아와 설치류 microglia에 비해 뚜렷한 속성을 전시. 이 프로토콜은 성인 인간의 뇌에서 기본 마이크로 글리아의 격리를위한 효율적인 방법을 제공합니다. 이러한 microglia를 연구 하는 microglia와 CNS에 있는 다른 상주 세포 인구 사이 세포 세포 상호 작용에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다., oligodendrocytes, 뉴런 및 성상 세포. 또한, 다른 인간의 두뇌에서 microglia 개인화 된 약및 치료 응용 프로그램의 무수한에 대 한 독특한 면역 반응의 특성화를 위해 배양 될 수 있습니다.

서론

중추 신경계(CNS)는 뉴런 과 신경교 세포1의복잡한 네트워크로 구성된다. 신경교 세포 중, 마이크로글리아는 CNS2,,3의타고난 면역 세포로서 기능한다. Microglia는 건강한 CNS4에서항상성을 유지하는 데 책임이 있습니다. Microglia는 또한 시냅스2를가지치기하여 신경 발달에 중요한 역할을합니다. Microglia는 여러 신경 질환의 병리생리학의 중심이지만 제한되지 는 않습니다. 알츠하이머병5,파킨슨병6,뇌졸중7,다발성 경화증8,외상성 뇌손상9,신경병성 통증10,척수 손상11, 진모(12) 등의 뇌종양이 있다.12

CNS 항상성 및 질병과 관련된 연구는 비용 효율적이고 시간 효율적인 인간 1 차 적인 microglia 격리 프로토콜13의땅때문에 설치류 microglia를 이용합니다. 설치류 마이크로글리아는 Iba-1, PU.1, DAP12 및 M-CSF 수용체와 같은 유전자의 발현에서 1차 인간 마이크로글리아를 유사하게 하며, 병든뇌(13)뿐만아니라 정상을 이해하는 데 효과적이었다. 흥미롭게도, TLR4, MHC II, 시글리크-11 및 시그렉-3과 같은 여러 면역 관련 유전자의 발현은 인간과 설치류마이크로글리아(13)사이에 다릅니다. 여러 유전자의 발현은 또한 두 종14,,15에서측현현 및 신경 퇴행성 질환에서 변화한다. 이러한 중요한 차이는 인간 microglia 항상성 및 질병에 있는 microglia 기능을 공부하는 필수적인 모형을 만듭니다. 1차 인간 마이크로글리아는 잠재적약물후보(16)의전임상 검진을 위한 효과적인 도구가 될 수 있다. 위에서 언급 한 이유는 기본 인간 microglia의 격리를위한 비용 효율적인 프로토콜에 대한 필요성을 강조한다.

우리는 종양 절제술 또는 그밖 외과 절제술을 위해 생성된 외과 창결과로 집합된 성인 인간 두뇌 조직에서 1 차적인 인간 microglia의 격리를 위한 프로토콜을 개발했습니다. 여기서 방법은 기존 방법과 상당히 다릅니다. 우리는 조직 수집 현장에서 실험실에서 격리 프로토콜을 시작하는 약 75 분의 전송 시간 후에 격리하고 배양 microglia를 할 수 있었습니다. 우리는 격리 된 microglia의 성장을 촉진하기 위해 L929 섬유 아세포 세포의 상체를 사용했습니다. 이 방법은 특히 1 차 microglia의 문화와 개발에 초점을 맞추고 있습니다. 준비된 결과 배양은 약 80% 마이크로글리아입니다. 다른 프로토콜은 밀도 그라데이션 원심 분리, 유동 세포측정 및 자기 구슬에 의해 미세글리아의 농축 된 배양을 제공하지만, 프로토콜은 1차,인간 microglia17,18,19,,20을배양하는 신속하고 간단하며 견고하며 비용 효율적인 방법입니다., 시체에서 고정 된 뇌 조직 대신 외과적으로 제거 된 살아있는 성인 뇌 조직을 활용하는 능력은 기존 절차(18,,21)와는 대조적으로이 방법의 추가 이점을 입증한다.

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프로토콜

모든 조직은 인도 공과 대학 조드푸르와 모든 인도 의학 연구소 (AIIMS) Jodhpur의 연구소 윤리위원회에서 윤리적 허가 후 인수되었다.

1.조직 취득 및 처리(0일차)

  1. 얼음차가운 인공 뇌척수액(aCSF) 10mL(aCSF) (2mM CaCl2∙2H2O,10mM포도당, 3mM KCl, 26m MM NaHCO3,2.5mM NaHCO 3, 2.5mM NaHCO 3, 2.5mM MM MgCl2+6H42,202m)를 함유한50mL튜브에서 조직을 수집하십시오.2 조직을 다른 위치로 옮겨야 하는 경우 튜브를 얼음 위에 보관해야 합니다.
    참고: 자동화된 증류수에서 aCSF를 준비합니다. 라미나르 후드에 0.22 μm 주사기 필터로 필터링합니다. 이것은 4 °C에서 1 개월 동안 저장할 수 있습니다.
  2. 수집 튜브를 70% 알코올로 조심스럽게 닦고 무균 라미나르 공기 흐름 챔버로 옮겨보세요.
  3. aCSF를 신중하게 폐기하고 무균 상태에서 조직을 계량하십시오. 조직 무게는 후속 단계에 필요한 트립신-EDTA의 부피를 계산하는 데 필수적입니다.
  4. 조직을 37°C에서 5분간 신선한 따뜻한 aCSF로 유지합니다. 이 단계는 세포 사멸을 피하기 위해 중요합니다.
  5. aCSF를 버리고 37 °C에서 1 x PBS (인산염 완충식염)로 조직을 한 번 씻으십시오. 모든 혈액이 반복되는 PBS 세척(필요에 따라)으로 씻어내도록 하십시오.
  6. 37°C에서 5분 동안 따뜻한 PBS에서 조직을 배양합니다.
  7. PBS를 신중하게 폐기하고 조직을 멸균 된 페트리 접시로 옮기십시오. PBS는 파이펫으로 제거될 수 있다. 이것은 조직의 손실을 방지 할 수 있습니다.
  8. 멸균 메스를 사용하여 조직을 작은 (적어도 1mm3)조각으로 주사위. 잘게 썬 조직은 더 높은 수율을 보장하는 트립신-EDTA에 의한 조직 해리를 위한 더 높은 조직 표면적을 제공합니다.
  9. 다진 조직을 0.25% 트립신-EDTA의 10mL/g 조직을 포함하는 50mL 튜브로 옮기고 10mL 세로지피펫을 통해 파이펫을 섞는다. 페트리 접시에 트립신/EDTA 2mL을 넣고 파이펫의 도움으로 접시를 철저히 씻으십시오. 이 트립신을 다시 매 튜브에 추가합니다. 이것은 다이싱하는 동안 조직과 세포의 손실을 최소화합니다.
  10. 250 rpm에서 37 °C에서 30 분 동안 셰이커에 튜브를 배양하십시오. 이 단계는 조직에서 세포의 해리를 증가시킵니다.
  11. 인큐베이션의 끝에서, 중화 매체의 10 mL을 추가 (50% DMEM / 50% F12 글루타민, 1% 페니실린 연쇄 절제술, 10% FBS) 트립신을 중화. 10mL 세로지오피펫과 섞으세요. 추가된 중화 매체의 양은 사용된 트립신의 양과 같아야 합니다.
  12. 10 분 동안 4 °C에서 2,000 x g에서 튜브를 원심 분리합니다.
  13. 상체를 버리고 배양 배지 의 1 mL에서 펠릿을 다시 중단하십시오 (글루타민50% DMEM/50% F12, 페니실린-연쇄 절제술 1%, 20% L929 상류제, 10% FBS).
    참고: L929 세포는 DMEM에서 배양(글루타민을 가진 DMEM, 1% 페니실린 연쇄절제술, 10% FBS)입니다. ATCC 권장 배양 방법은 세포 배양을 위해 따라야 한다. 수퍼네티트는 적어도 75% 컨실업인 문화 플라스크에서 수집해야 합니다. 그것은 대량으로 수집 및 성장 인자의 저하를 방지하기 위해 -80 °C에 저장 할 수 있습니다. 주식 문화 배지에 추가하는 대신 플라스크에 L929 상체를 별도로 추가하는 것이 좋습니다.
  14. T-25 플라스크에서 세포를 플레이트, 부착 세포에 적합, 추가 배양 배지의 4 mL을 추가. 플라스크를 37°C에서 5% CO2로배양한다. 플라스크를 조심스럽게 흔들어 균질적으로 조직을 분산시하십시오. 오염의 가능성을 증가시킬 수 있기 때문에, 흔들면서, 플라스크의 목에 미디어를 가져 오지 마십시오.

2.세포 배양(2일차)

  1. T-25 배양 플라스크에서 미디어를 수집하여 각 튜브에서 동일한 양의 미디어를 수집하여 3개의 1.5mL 원심분리기 튜브에서 0일에 제조됩니다. 플라스크를 1 x PBS로 한 번 씻으세요. 플라스크를 부드럽게 흔들어 남은 조직 조각을 제거합니다. 남은 조각이 문화에 부정적인 영향을 미치지 않기 때문에 플라스크의 가혹한 흔들림을 피하십시오. 플라스크에 5mL 의 신선한 문화 미디어를 추가합니다.
  2. 수집된 매체를 4°C에서 4°C에서 1,466xg(4000rpm)에서 4분간 원심분리합니다.
  3. 각 튜브에서 상체를 버리고 튜브 중 하나에 1 mL의 배양 매체를 추가합니다. 파이펫과 철저히 섞으세요. 연일 다른 튜브에 셀이 혼합 된 미디어를 추가합니다. 파이펫과 철저히 섞고 세포를 하나의 튜브에 풀로 두세요.
  4. 분리된 T-25 플라스크에서 세포를 플레이트, 부착 세포에 적합. 배양 배지 4mL를 추가하고 플라스크를 37°C에서 5% CO2로배양한다.

3.세포 배양(4일차)

  1. 플라스크에서 미디어를 폐기하고 플라스크에 새로운 5mL의 문화 매체를 추가합니다.
  2. 플라스크를 37°C에서 2일 동안 5%CO2로 배양한다.

4. 세포 배양 (6일차)

  1. 세포는 추가 실험을 위해 준비될 것입니다.

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결과

위에서 언급한 프로토콜(도1)을사용하여, 우리는 1차 인간 마이크로글리아를 외과적으로 절제된 뇌 조직으로부터 분리할 수 있었다. 배양된 세포는 미세글리아(green)에 대한 리시누스 공동체 agglutin-1(RCA-1) 렉틴과 성상세포(red)(도 2)를 위해 염색하였다(도2)이전에 설명된 바와 같이22,,23,,24,,25,,26. 4′,6-디아미드노-2-페닐린돌(DAPI)은 핵(blue)을 염색하는 데 사용되었다. 실험 시작후 6일째에 세포는 추가 실험을 ...

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토론

Microglia는 정상적인 뇌의 항상성을 보장하고 다양한 신경 질환4의 병리4생리학에서 중심적인 역할을한다. Microglia는 신경 발달과 시냅스2의형성의 중심입니다. Microglial 연구는 다양한 신경질환4의발달과 진행을 이해하는 데 중추적 인 것으로 입증되었습니다. 설치류 microglia는 1 차적인 microglial 연구 결과를 위한 선택의 널리 퍼진 모형입니다, 비록, 설치류 microglia는 주요 양상에 있는 1 차적인 인간 microglia와 다릅니다13. 비용 효율적인, 높은 항복, 기본 인간 microglia의 격리를 위한 프로토콜의 개발이 격차를 해소하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 살아있는에서 1 차적인 인간 microglia의 격리를 위한 프로토콜을 개발했습니다, 외과적으로 절제된, 성인, 인간 적인 두뇌 조직. 우리는 ...

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공개 사항

저자는 공개 할 것이 없습니다.

감사의 글

SJ의 실험실은 IITJ의 기관 보조금으로 설립되었으며 생명공학부(BT/PR12831/MED/30/1489/2015)와 인도 전자정보기술부(No.4(16호)/2019-ITEA의 보조금으로 지원받고 있습니다. 인간의 뇌 조직 섹션은 기관 윤리위원회 허가 후 의학의 모든 인도 연구소 (AIIMS) Jodhpur에서 얻은. 비디오 그래피 지원을 위해 디자인 및 예술 협회 IIT Jodhpur의 B.Tech 학생 회원인 마야크 라토르에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
항생제-항진균 용액HimediaA002
염화칼슘시그마223506
원심분리기 (4 ° C)시그마146532
원심분리기 튜브AbdosP10203
CO2 인큐베이터New BrunswikGalaxy 170 S
D-GlucoseHimediaGRM077
DMEM medium with glutamineHimediaAL007S
Fetal bovine serumHimediaRM9955
Flacon 튜브 (50 ml)Thermo Fsiher Scientific 50CD1058
Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1VectorFL-1081
형광 현미경LeicaDM2000LED
Fluoroshield with DAPISigmaF6057
GFAP 항체GA53670S
인큐베이터 쉐이커New Brunswik ScientificInnova 42
L929 세포주ATCCNCTC 클론 929 [L 세포, L-929, 균주 L의 유도체] (ATCC  CCL-1)
층Thermo Fsiher Scientific 1386
염화마그네슘HimediaMB040
인산일나트륨Merck567545
영양 혼합물 F-12 햄 매체HimediaAl106S
페트리 접시Duran Group237554805
인산염 완충 식염수HimediaML023
염화칼륨HimediaMB043
혈청 피펫LabwareLW-SP1010
중탄산 나트륨HimediaMB045
설탕HimediaMB025
주사기 필터 (0.2μ;, 직경 25mm)적합한 Axiva
T-25 조직 배양 플라스크.HimediaTCG4-20X10NO
트립신-EDTA (0.25%)Gibco 제25200-056
류 부착 세포 배양에 SFPV25R 호

참고문헌

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  16. Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer's disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44(2018).
  17. Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
  18. Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16(2017).
  19. Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371(2016).
  20. Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
  21. Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
  22. Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811(2010).
  23. Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
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  26. Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
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  28. Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
  29. Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).

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