成人ヒト脳組織からのヒトミクログリアの取得
Summary
このプロトコルは、生きている、大人、人間の脳組織から原発ミクログリアを単離する効率的で費用対効果が高く、堅牢な方法です。孤立した原発性ヒトミクログリアは、恒常性および疾患における細胞プロセスを研究するためのツールとして役立つ。
Abstract
ミクログリアは中枢神経系の自然免疫細胞(CNS)に居住している。ミクログリアは、発達中、恒常性維持、感染または傷害の間に重要な役割を果たす。いくつかの独立した研究グループは、ミクログリアが自己免疫疾患、自己炎症性症候群および癌において果たす中心的な役割を強調している。いくつかの神経疾患におけるミクログリアの活性化は、病原性プロセスに直接関与する可能性があります。原発性ミクログリアは、脳内の免疫応答、細胞と細胞の相互作用、疾患における調節不全ミクログリア型を理解するための強力なツールです。一次ミクログリアは、不死化ミクログリア細胞株よりもビボミクログリア特性を模倣する。ヒト成人ミクログリアは、ヒト胎児およびげっ歯類ミクログリアと比較して、異なる特性を示す。このプロトコルは、成人の人間の脳から原発性ミクログリアを分離するための効率的な方法を提供する。これらのミクログリアを研究することは、オリゴデンドロサイト、ニューロンおよびアストロサイトを含むCNSにおけるミクログリアと他の居住細胞集団との間の細胞細胞相互作用に関する重要な洞察を提供することができる。さらに、異なる人間の脳からのミクログリアは、個別化された医療のためのユニークな免疫応答の特徴付けと無数の治療用途のために培養することができる。
Introduction
中枢神経系(CNS)は、ニューロンとグリア細胞の複雑なネットワーク1で構成されている。グリア細胞の中でも、ミクログリアはCNS2,3,3の自然免疫細胞として機能する。ミクログリアは健康なCNS4で恒常性を維持する責任があります。ミクログリアはまた、シナプス2を剪定することによって、神経発達において重要な役割を果たす。ミクログリアは、含むが、制限されていないいくつかの神経疾患の病態生理学の中心です。アルツハイマー病5、パーキンソン病6、脳卒中7、多発性硬化症8、外傷性脳損傷9、神経因性疼痛10、脊髄損傷11および神経膠腫などの脳腫瘍12。
CNS恒常性および疾患に関する研究は、コスト効率が良く、時間効率の高いヒト原発性ミクログリア分離プロトコル13の枯渇に起因するげっ歯類ミクログリアを利用する。げっ歯類ミクログリアは、イバ-1、PU.1、DAP12およびM-CSF受容体などの遺伝子の発現において原発性ヒトミクログリアに類似しており、疾患を有する脳13と同様に正常な理解に有効であった。興味深いことに、TLR4、MHC II、Siglec-11およびSiglec-3などのいくつかの免疫関連遺伝子の発現は、ヒトおよびげっ歯類ミクログリア13との間で変化する。いくつかの遺伝子の発現は、両方の種14,15,15の経時的発現および神経変性疾患においても変化する。これらの有意な違いは、ヒトミクログリアを恒常性および疾患におけるミクログリア機能を研究するために不可欠なモデルにする。原発性ヒトミクログリアはまた、潜在的な薬物候補16の前臨床スクリーニングのための効果的なツールであり得る。上記の理由は、一次ヒトミクログリアの分離のための費用対効果の高いプロトコルの必要性の高まりを強調しています。
我々は、腫瘍切除または他の外科的切除のために作成された外科的窓の結果として収集された成人ヒト脳組織から原発ヒトミクログリアを単離するためのプロトコルを開発した。この方法は既存の方法とは大きく異なります。組織採取部位から約75分後にミクログリアを単離培養し、実験室で隔離プロトコルを開始することができた。我々は、単離ミクログリアの増殖を促進するためにL929線維芽細胞の上清を使用している。この方法は、特に、一次ミクログリアのみの培養と開発に焦点を当てています。得られた培養物は約80%ミクログリアである。他のプロトコルは、密度勾配遠心分離、フローサイトメトリーおよび磁気ビーズによってミクログリアの豊かな培養を提供する一方で、プロトコルは、一次ヒトミクログリア17、18、19、2018,19,を培養するための迅速でシンプルで堅牢で費用対効果の高い方法である。1720死体から固定された脳組織の代わりに外科的に除去された生きた成人の脳組織を利用する能力は、既存の手順18,21とは対照的に、21この方法の付加的な利点を証明する。
Protocol
Representative Results
Discussion
ミクログリアは、正常な脳における恒常性を確保し、様々な神経疾患の病態生理学において中心的な役割を果たす4.ミクログリアは、シナプス2の神経発達と形成の中心である。ミクログリア研究は、多様な神経疾患の発症と進行を理解する上で極めて重要であることが証明されている 4.げっ歯類ミクログリアは、一次ミクログリア研究の?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SJの研究所は、IITJの機関補助金を受けて設立され、バイオテクノロジー省(BT/PR12831/MED/30/10/1089/2015)とインド電子情報技術省(No.4(16)/2019-ITEA)からの助成金を受けています。ヒトの脳組織切片は、全インド医科学研究所(AIIMS)ジョードプルから制度倫理委員会のクリアランスの後に得られた。デザイン・アンド・アーツ・ソサエティIIT JodhpurのB.Tech学生メンバーであるMayank Rathorに、ビデオ撮影のサポートに感謝します。
Materials
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
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