Erhålla mänskliga Microglia från Vuxna mänskliga hjärnvävnaden
Summary
Detta protokoll är en effektiv, kostnadseffektiv och robust metod för att isolera primär mikroglia från levande, vuxen, mänsklig hjärnvävnad. Isolerade primära mänskliga mikroglia kan fungera som ett verktyg för att studera cellulära processer i homeostas och sjukdom.
Abstract
Microglia är bosatta medfödda immunceller i centrala nervsystemet (CNS). Microglia spela en avgörande roll under utveckling, för att upprätthålla homeostas, och under infektion eller skada. Flera oberoende forskargrupper har belyst den centrala roll som mikroglia spelar i autoimmuna sjukdomar, autoinflammatory syndrom och cancer. Aktiveringen av mikroglia i vissa neurologiska sjukdomar kan direkt delta i patogena processer. Primär mikroglia är ett kraftfullt verktyg för att förstå immunsvaren i hjärnan, cell-cell interaktioner och dysregulated microglia fenotyper i sjukdom. Primär microglia härma in vivo mikroglial egenskaper bättre än förevigade mikroglial cellinjer. Mänskliga vuxna microglia uppvisar distinkta egenskaper jämfört med mänskliga fetala och gnagare microglia. Detta protokoll ger en effektiv metod för isolering av primär mikroglia från vuxna mänskliga hjärnan. Studera dessa microglia kan ge kritiska insikter i cell-cell interaktioner mellan microglia och andra bosatta cellulära populationer i CNS inklusive, oligodenadrocytes, nervceller och astrocyter. Dessutom kan mikroglia från olika mänskliga hjärnor odlas för karakterisering av unika immunsvar för personlig medicin och en myriad av terapeutiska tillämpningar.
Introduction
Det centrala nervsystemet (CNS) är konstruerad av ett komplext nätverk av nervceller och gliaceller1. Bland de gliaceller, microglia funktion som de medfödda immuncellerna i CNS2,3. Microglia ansvarar för att upprätthålla homeostas i den friska CNS4. Microglia spelar också en viktig roll i neuroutveckling, genom beskärning synapser2. Microglia är centrala för patofysiologi av flera neurologiska sjukdomar inklusive men inte begränsat till; Alzheimers sjukdom5, Parkinsons sjukdom6, stroke7, multipel skleros8, traumatisk hjärnskada9, neuropatisk smärta10, ryggmärgsskada11 och hjärntumörer som gliomas12.
Studier relaterade till CNS homeostas och sjukdomar utnyttja gnagare microglia på grund av en brist på kostnadseffektiva och tidseffektiva mänskliga primära microglia isolering protokoll13. Gnagare mikroglia likna primära mänskliga mikroglia i uttryck av gener som Iba-1, PU.1, DAP12 och M-CSF receptorn och har varit effektiva i att förstå normala samt sjuka hjärnan13. Intressant nog varierar uttrycket av flera immun relaterade gener såsom TLR4, MHC II, Siglec-11 och Siglec-3 mellan människa och gnagare microglia13. Uttrycket av flera gener varierar också i temporala uttryck och i neurodegenerativa sjukdomar hos bådaarterna 14,15. Dessa betydande skillnader gör mänskliga microglia en viktig modell för att studera microglia funktion i homeostas och sjukdom. Primär människa microglia kan också vara ett effektivt verktyg för preklinisk screening av potentiella läkemedelskandidater16. De ovan nämnda orsakerna understryker det växande behovet av kostnadseffektiva protokoll för isolering av primära mänskliga mikroglia.
Vi har utvecklat ett protokoll för isolering av primära mänskliga microglia från vuxna mänskliga hjärnvävnad som samlats in som ett resultat av kirurgiska fönster skapas för tumör samband eller andra kirurgiska samband. Metoden här skiljer sig avsevärt från befintliga metoder. Vi kunde isolera och odla mikroglia efter en transittid på ca 75 minuter från vävnadsinsamlingsplatsen för att starta isoleringsprotokollet i laboratoriet. Vi har använt supernatanten av L929 fibroblastceller för att främja tillväxten av isolerad mikroglia. Denna metod fokuserar specifikt på kulturen och utvecklingen av endast primära microglia. Den resulterande kulturen beredd är ca 80% mikroglia. Medan andra protokoll ger en berikad kultur av mikroglia genom densitet gradient centrifugering, flödescytometri och magnetiska pärlor, är protokollet en snabb, enkel, robust och kostnadseffektivt sätt att kultur primära mänskliga mikroglia17,18,19,20. Förmågan att utnyttja kirurgiskt bort levande vuxna hjärnvävnad i stället för fasta hjärnvävnader från kadaver visar en extra fördel av denna metod i motsats till befintliga förfaranden18,21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Microglia säkerställa homeostas i den normala hjärnan och spela centrala roller i patofysiologi av olika neurologiska sjukdomar4. Microglia är centrala för neuroutveckling och bildande av synapser2. Mikroglialstudier har visat sig vara avgörande för att förstå utvecklingen och utvecklingen av olika neurologiska sjukdomar4. Gnagare microglia är den förhärskande modellen av val för primära mikroglialstudier, även om, gnagare microglia sk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SJs laboratorium inrättades med institutionella bidrag från IITJ och finansieras genom bidrag från Institutionen för bioteknik (BT/PR12831/MED/30/1489/2015) och Ministry of Electronics and Information Technology Government of India (No.4(16)/2019-ITEA). Den mänskliga hjärnvävnad avsnitten erhölls från All India Institute of Medical Sciences (AIIMS) Jodhpur efter institutionella etik kommitté godkännande. Vi tackar Mayank Rathor, B.Tech Student medlem av Design och Konst Samhälle IIT Jodhpur, för videography stöd.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic solution | Himedia | A002 | |
| Calcium chloride | Sigma | 223506 | |
| Centrifuge (4 °C) | Sigma | 146532 | |
| Centrifuge tubes | Abdos | P10203 | |
| CO2 incubator | New Brunswik | Galaxy 170 S | |
| D-Glucose | Himedia | GRM077 | |
| DMEM medium with glutamine | Himedia | AL007S | |
| Fetal bovine serum | Himedia | RM9955 | |
| Flacon tube (50 ml) | Thermo Fsiher Scientific | 50CD1058 | |
| Fluorescein Ricinus communis agglutinin-1 | Vector | FL-1081 | |
| Fluorescent microscope | Leica | DM2000LED | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma | F6057 | |
| GFAP antibody | GA5 | 3670S | |
| Incubator shaker | New Brunswik Scientific | Innova 42 | |
| L929 cell line | ATCC | NCTC clone 929 [L cell, L-929, derivative of Strain L] (ATCC CCL-1) | |
| Laminar air flow | Thermo Fsiher Scientific | 1386 | |
| Magnesium chloride | Himedia | MB040 | |
| Monosodium phosphate | Merck | 567545 | |
| Nutrient Mixture F-12 Ham Medium | Himedia | Al106S | |
| Petri dish | Duran Group | 237554805 | |
| Phosphate buffered saline | Himedia | ML023 | |
| Potassium chloride | Himedia | MB043 | |
| Serological pipette | Labware | LW-SP1010 | |
| Sodium bicarbonate | Himedia | MB045 | |
| Sucrose | Himedia | MB025 | |
| Syringe filter (0.2μ, 25 mm diameter) | Axiva | SFPV25R | |
| T-25 tissue culture flasks suitable for adherent cell culture. | Himedia | TCG4-20X10NO | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200-056 |
References
- Allen, N. J., Barres, B. A. Glia – more than just brain glue. Nature. 457 (7230), 675-677 (2009).
- Lenz, K. M., Nelson, L. H. Microglia and Beyond: Innate Immune Cells As Regulators of Brain Development and Behavioral Function. Frontiers in Immunology. 9 (698), (2018).
- Gordon, S., Plüddemann, A., Martinez Estrada, F. Macrophage heterogeneity in tissues: phenotypic diversity and functions. Immunological Reviews. 262 (1), 36-55 (2014).
- Li, Q., Barres, B. A. Microglia and macrophages in brain homeostasis and disease. Nature Reviews Immunology. 18 (4), 225-242 (2018).
- Hansen, D. V., Hanson, J. E., Sheng, M. Microglia in Alzheimer’s disease: A microglial conundrum. Journal of Cell Biology. 217 (2), 459-472 (2017).
- Tremblay, M. -. E., Cookson, M. R., Civiero, L. Glial phagocytic clearance in Parkinson’s disease. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 16 (2019).
- Qin, C., et al. Dual Functions of Microglia in Ischemic Stroke. Neuroscience Bulletin. 35 (5), 921-933 (2019).
- Voet, S., Prinz, M., van Loo, G. Microglia in Central Nervous System Inflammation and Multiple Sclerosis Pathology. Trends in Molecular Medicine. 25 (2), 112-123 (2019).
- Loane, D. J., Kumar, A. Microglia in the TBI brain: The good, the bad, and the dysregulated. Experimental Neurology. 275 (03), 316-327 (2016).
- Inoue, K., Tsuda, M. Microglia in neuropathic pain: cellular and molecular mechanisms and therapeutic potential. Nature Reviews Neuroscience. 19 (3), 138-152 (2018).
- Bellver-Landete, V., et al. Microglia are an essential component of the neuroprotective scar that forms after spinal cord injury. Nature Communications. 10 (1), 518 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/Brain Macrophages as Central Drivers of Brain Tumor Pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Smith, A. M., Dragunow, M. The human side of microglia. Trends in Neurosciences. 37 (3), 125-135 (2014).
- Galatro, T. F., et al. Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes. Nature Neuroscience. 20 (8), 1162-1171 (2017).
- Friedman, B. A., et al. Diverse Brain Myeloid Expression Profiles Reveal Distinct Microglial Activation States and Aspects of Alzheimer’s Disease Not Evident in Mouse Models. Cell Reports. 22 (3), 832-847 (2018).
- Rustenhoven, J., et al. PU.1 regulates Alzheimer’s disease-associated genes in primary human microglia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 44 (2018).
- Sierra, A., Gottfried-Blackmore, A. C., McEwen, B. S., Bulloch, K. Microglia derived from aging mice exhibit an altered inflammatory profile. Glia. 55 (4), 412-424 (2007).
- Mizee, M. R., et al. Isolation of primary microglia from the human post-mortem brain: effects of ante- and post-mortem variables. Acta Neuropathologica Communications. 5 (1), 16 (2017).
- Rustenhoven, J., et al. Isolation of highly enriched primary human microglia for functional studies. Scientific Reports. 6 (1), 19371 (2016).
- Spaethling, J. M., et al. Primary Cell Culture of Live Neurosurgically Resected Aged Adult Human Brain Cells and Single Cell Transcriptomics. Cell Reports. 18 (3), 791-803 (2017).
- Olah, M., et al. An optimized protocol for the acute isolation of human microglia from autopsy brain samples. Glia. 60 (1), 96-111 (2012).
- Jha, S., et al. The Inflammasome Sensor, NLRP3, Regulates CNS Inflammation and Demyelination via Caspase-1 and Interleukin-18. The Journal of Neuroscience. 30 (47), 15811 (2010).
- Freeman, L., et al. NLR members NLRC4 and NLRP3 mediate sterile inflammasome activation in microglia and astrocytes. Journal of Experimental Medicine. 214 (5), 1351-1370 (2017).
- Plant, S. R., et al. Lymphotoxin beta receptor (Lt betaR): dual roles in demyelination and remyelination and successful therapeutic intervention using Lt betaR-Ig protein. The Journal of Neuroscience. 27 (28), 7429-7437 (2007).
- Arnett, H. A., et al. The Protective Role of Nitric Oxide in a Neurotoxicant- Induced Demyelinating Model. The Journal of Immunology. 168 (1), 427 (2002).
- Arnett, H. A., et al. TNFα promotes proliferation of oligodendrocyte progenitors and remyelination. Nature Neuroscience. 4 (11), 1116-1122 (2001).
- Trouplin, V., et al. Bone marrow-derived macrophage production. Journal of Visualized Experiments. (81), e50966 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of Rat Bone Marrow Cells Into Macrophages Under the Influence of Mouse L929 Cell Supernatant. Journal of Leukocyte Biology. 41 (1), 83-91 (1987).
- Englen, M. D., Valdez, Y. E., Lehnert, N. M., Lehnert, B. E. Granulocyte/macrophage colony-stimulating factor is expressed and secreted in cultures of murine L929 cells. Journal of Immunological Methods. 184 (2), 281-283 (1995).
