מסך מדכא לאפיון קישורים גנטיים ויסות תוחלת חיים כרונולוגית ב Saccharomyces cerevisiae
Summary
הנה פרוטוקול לזיהוי אינטראקציות גנטיות באמצעות מסך מדכא מספר עותק מוגבר ב Saccharomyces cerevisiae. שיטה זו מאפשרת לחוקרים לזהות, לשבט ולבדוק מדכאי מוטנטים שמרים קצרי מועד. אנו בודקים את ההשפעה של הגדלת מספר עותק של SIR2 על תוחלת החיים במוטציה null autophagy.
Abstract
הזדקנות היא ההידרדרות התלויה בזמן של התהליכים הביולוגיים הרגילים של אורגניזם שמגבירה את ההסתברות למוות. גורמים גנטיים רבים תורמים לשינויים בתהליך ההזדקנות הרגיל. גורמים אלה מצטלבים בדרכים מורכבות, כפי שמעיד העושר של קישורים מתועדים שזוהו וורגנו באורגניזמים רבים. רוב המחקרים מתמקדים באובדן תפקוד, מוטציות Null המאפשרות הקרנה מהירה של גנים רבים בו זמנית. יש הרבה פחות עבודה שמתמקדת באיפיון התפקיד שבאופן יתר של גן בתהליך זה. בעבודה הנוכחית, אנו מציגים מתודולוגיה פשוטה כדי לזהות ולשבט גנים שמרים ניצנים, Saccharomyces cerevisiae, למחקר בדיכוי של פנוטיפ תוחלת החיים כרונולוגי קצר תוחלת חיים לראות ברקעים גנטיים רבים. פרוטוקול זה נועד להיות נגיש לחוקרים ממגוון רחב של רקעים ובצבים אקדמיים שונים. הגן SIR2, אשר קודים עבור deacetylase histone, נבחר לשיבוט בוקטור pRS315, כפי שהיו דיווחים סותרים על השפעתו על תוחלת החיים הכרונולוגית. SIR2 גם ממלא תפקיד autophagy, אשר תוצאות כאשר משובש באמצעות מחיקה של מספר גנים, כולל גורם שעתוק ATG1. כהוכחה עקרונית, אנו משכפלים את הגן SIR2 כדי לבצע מסך מדכא על פנוטיפ תוחלת החיים המקוצר האופייני למוטציה הפגויה באוטופיה ולהשוות אותו לרקע גנטי איזוגני, פראי.
Introduction
הזדקנות היא אובדן תלוי הזמן של יושרה בתהליכים ביולוגיים אינספור שבסופו של דבר מגביר את ההסתברות למוות אורגני. הזדקנות היא כמעט בלתי נמנעת עבור כל המינים. ברמה התאית ישנם מספר סימני היכר מאופיינים היטב הקשורים להזדקנות, כולל: חוסר יציבות גנומית, שינויים אפיגנטיים, אובדן פרוטאוסטזיס, תפקוד מיטוכונדריאלי, חישה תזונתית מפוקחת, רגישות תאית, והתשהטלומר 1,,2. באורגניזמים חד-תאיים, כגון שמרים, הדבר מוביל לירידה בפוטנציאל המשכפל ותורוחהחיים הכרונולוגית 3,4. שינויים תאיים אלה באים לידי ביטוי אורגניזמים מורכבים יותר, כמו בני אדם, כמו פתולוגיות הכוללות סרטן, אי ספיקת לב, ניוון עצבי, סוכרת,אוסטאופורוזיס 5,,6,7. למרות המורכבות הרבות המאפיינת את תהליך ההזדקנות, יש שימור של סימני ההיכר המולקולריים האלה, המקמים את התהליך הזה על פני אורגניזמיםמפוצלים נרחבים 8,9,10. זיהוי של שינויים במסלולים אלה במהלך ההזדקנות הוביל להבנה כי הם יכולים להיות מניפולציה באמצעות שינויים באורח החיים – הגבלה תזונתית מוצגת להאריך באופן משמעותי את תוחלתהחיים באורגניזמים רבים 11. מסלולים אלה מתכנסים ומצטלבים זה עם זה ועם מסלולים רבים אחרים, בדרכים מורכבות. ההתללות והאפיון של אינטראקציות אלה מציעות פוטנציאל להתערבויות טיפוליות כדי להאריך את תוחלת החיים ואת תוחלתהחיים 12,,13,14.
שימור התבניות המולקולריות מאפשר ניתוח פונקציונלי של אינטראקציות גנטיות הבסיס לתהליך באמצעות אורגניזמים מודל פשוט יותר – כולל שמרים ניצנים, Saccharomyces cerevisiae15,16. ישנם שני סוגים מבוססים של הזדקנות במודל על ידי שמרים ניצנים: הזדקנות כרונולוגית (תוחלת החיים הכרונולוגית, CLS) והזדקנות משוכפלת (תוחלת החיים משוכפלת, RLS)17. הזדקנות כרונולוגית מודדת את משך הזמן שתא יכול לשרוד במצב שאינו מחולק. זה מקביל להזדקנות כי הוא נראה בתאים שמבלים את רוב חייהם ב G0, כגון נוירונים4. לחלופין, תוחלת חיים משוכפלת היא מספר הפעמים שתא יכול לחלק לפני תשישות והוא מודל עבור סוגי תאים פעילים mitotically (למשל, מספר תאי הבת כי תא יכול להיות)18.
המטרה הכוללת של שיטה זו היא להציג פרוטוקול המאפשר ניתוח פונקציונלי של הגנטיקה של הזדקנות באמצעות S. cerevisiae. אמנם היו מחקרים מצוינים רבים שבוצעו על ידי חוקרים רבים שהובילו להבנה הנוכחית שלנו, נותרו הזדמנויות רבות זמינות עבור חוקרים ניצנים לתרום לתחום ההזדקנות מתחילת הקריירה האקדמית שלהם. אנו מציגים מתודולוגיה ברורה שתאפשר לחוקרים לקדם עוד יותר את תחום ההזדקנות. פרוטוקול זה נועד להיות נגיש לכל החוקרים ללא קשר לשלב בקריירה האקדמית שלהם על ידי מתן הכלים הדרושים כדי לגבש ולבדוק את השערות הרומן שלהם. היתרון של הגישה שלנו הוא כי זוהי שיטה חסכונית נגישה לכל החוקרים ללא קשר למוסד – ואינה דורשת יקר, ציוד מיוחד הדרוש עבור פרוטוקולים מסוימים19. ישנן מספר דרכים שונות לעצב סוג זה של מסך, הגישה המתוארת בעבודה זו היא במיוחד מותנה מוטציות null של גנים לא חיוניים המציגים הפחתה חמורה תוחלת החיים הכרונולוגית לעומת זן איזוגניים מסוג בר של שמרים.
כהוכחה עקרונית שלנו, אנו לשבט SIR2, deacetylase לייסין דיווח כמוצג הן מורחבת CLS מקוצר כאשר בהגזמה. SIR2 overexpression נמצא לאחרונה להגדיל CLS שמרים ייצור יין; עם זאת, מספר קבוצות דיווחו על כל קשר בין הארכת SIR2 ל-CLS, והותירו את תפקידהתחת מאופיין 20,21,22. בשל דיווחים סותרים אלה בספרות, בחרנו בגן זה כדי להוסיף מחקר עצמאי כדי לעזור להבהיר את התפקיד של SIR2 בהזדקנות כרונולוגית, אם בכלל. בנוסף, הגדלת מספר העותק של הומולוג SIR2 מאריכה את תוחלת החיים במערכת מודל תולעת נמטודה23.
Autophagy היא מערכת השפלה תאית כדי לספק מוצרים cytosolic, כגון חלבונים organelles, כדי lysosome24. Autophagy מקושר באופן אינטימי אריכות ימים באמצעות תפקידו בהשפלה חלבונים פגומים organelles כדי לשמור על הוםאוסטזיס תאי25. אינדוקציה של autophagy תלוי תזמור הביטוי של גנים רבים, ואת המחיקה של הגן ATG1 תוצאות CLS קצר באופן חריג שמריםניצנים 26. ATG1 קודי עבור חלבון serine / קינאז threonine הנדרש עבור היווצרות שלוק autophagy ואת ציקופלסמה-כדי vacuole (המקבילה הפטרייתית lysomal)מסלול 27,28. כאן, אנו מציגים את השיטה שלנו עבור מסך מספר עותק מוגבר, בדיקת ההשפעה של עותק SIR2 מוגברת על CLS בסוג פראי ורקע atg1-null. שיטה זו מתאימה במיוחד לחוקרים זוטרים ולקבוצות מחקר במוסדות לתואר ראשון בעיקר, שרבים מהם משרתים קהילות שאינן מיוצגות כראוי במדעים ויש להן משאבים מוגבלים.
Protocol
Representative Results
Discussion
חשיפת הגנטיקה של הזדקנות היא אתגר קשה, עם הזדמנויות רבות למחקר נוסף שיכול להניב תובנות משמעותיות על האינטראקציות המורכבות הקיימות. ישנן שיטות רבות המאפשרות את הדור המהיר של מוטנטים אובדן תפקוד לחקר זנים null של שמרים45,46. שיטה זו מציגה גישה פשוטה כדי לזהות ולש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ג’יימס ט. ארנונה רוצה להכיר בתמיכת הסטודנטים במסלול טכנולוגיות הדנ”א הרקומביננטי ב-2017 ו-2018 באוניברסיטת ויליאם פטרסון שהיו מעורבים בפרויקט מראשיתו, אבל מאמציהם לא חצו את הסף לכתיבה: כריסטופר אנדינו, חואן בוטרו, ג’וזפין בוזאן, ברנדה קאלפה, ברנדה קובה, הדטאלאב אסל דדז’י, ארווין גאמארה, פרשסג’יפט איזיבור ויין קו, נלסון מג’יה, הקטור מוטולה, רביע נז, עבדאללה עודה, פרל פגונטלן, דניאל רזאי, גבריאלה רקטור, אאידה שנו ומתיו סו. אתם מדענים נהדרים ואני מתגעגע לכולכם!
המחברים רוצים להכיר בתמיכה רבת הערך של הוראה וטכנולוגיה מחקר באוניברסיטת ויליאם פטרסון על עזרתם: גרג מאטיסון, פיטר Cannarozzi, רוב מאייר, דנטה Portella, והנרי הייניטש. המחברים גם רוצים להכיר במשרד של הנשיא לתמיכה באמנות, משרד הדיקן והמרכז למחקר במכללה למדע ובריאות את תמיכתם בעבודה זו, ואת המחלקה לביולוגיה לתמיכה בפרויקט זה.
Materials
| Fungal/Bacterial DNA kit | Zymo Research | D6005 | |
| HindIIIHF enzyme | New England Biolabs | R3104S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Plasmid miniprep kit | Qiagen | 12123 | |
| SacII enzyme | New England Biolabs | R0157S | |
| Salmon sperm DNA | Thermofisher | AM9680 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S |
References
- López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Kenyon, C. The genetics of ageing. Nature. 464 (7288), 504-512 (2010).
- Petralia, R. S., Mattson, M. P., Yao, P. J. Aging and longevity in the simplest animals and the quest for immortality. Ageing Research Reviews. 16, 66-82 (2014).
- Longo, V. D., Fabrizio, P. . Aging Research in Yeast. , 101-121 (2011).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
- Galkin, F., Zhang, B., Dmitriev, S. E., Gladyshev, V. N. Reversibility of irreversible aging. Ageing Research Reviews. 49, 104-114 (2019).
- Khan, S. S., Singer, B. D., Vaughan, D. E. Molecular and physiological manifestations and measurement of aging in humans. Aging Cell. 16 (4), 624-633 (2017).
- Riera, C. E., Merkwirth, C., De Magalhaes Filho, C. D., Dillin, A. Signaling networks determining life span. Annual Review of Biochemistry. 85, 35-64 (2016).
- Powers, R. W., Kaeberlein, M., Caldwell, S. D., Kennedy, B. K., Fields, S. Extension of chronological life span in yeast by decreased TOR pathway signaling. Genes & Development. 20 (2), 174-184 (2006).
- Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C. elegans: signaling pathways for longevity. Trends in Endocrinology & Metabolism. 23 (12), 637-644 (2012).
- Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span-from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
- Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (4), 225-238 (2012).
- Bitto, A., et al. Transient rapamycin treatment can increase lifespan and healthspan in middle-aged mice. elife. 5, 16351 (2016).
- Fang, E. F., et al. NAD+ replenishment improves lifespan and healthspan in ataxia telangiectasia models via mitophagy and DNA repair. Cell Metabolism. 24 (4), 566-581 (2016).
- Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (1), 17-21 (2005).
- Fabrizio, P., et al. Genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae identifies vacuolar protein sorting, autophagy, biosynthetic, and tRNA methylation genes involved in life span regulation. PLoS Genetics. 6 (7), (2010).
- Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metabolism. 16 (1), 18-31 (2012).
- He, C., Zhou, C., Kennedy, B. K. The yeast replicative aging model. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2690-2696 (2018).
- Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73-81 (2003).
- Smith, J., Daniel, L., McClure, J. M., Matecic, M., Smith, J. S. Calorie restriction extends the chronological lifespan of Saccharomyces cerevisiae independently of the Sirtuins. Aging Cell. 6 (5), 649-662 (2007).
- Orozco, H., Matallana, E., Aranda, A. Genetic manipulation of longevity-related genes as a tool to regulate yeast life span and metabolite production during winemaking. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1 (2013).
- Tissenbaum, H. A., Guarente, L. Increased dosage of a sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 410 (6825), 227-230 (2001).
- Huang, W. P., Klionsky, D. J. Autophagy in yeast: a review of the molecular machinery. Cell Structure and Function. 27 (6), 409-420 (2002).
- Barbosa, M. C., Grosso, R. A., Fader, C. M. Hallmarks of aging: an autophagic perspective. Frontiers in Endocrinology. 9, 790 (2019).
- Aris, J. P., et al. Autophagy and leucine promote chronological longevity and respiration proficiency during calorie restriction in yeast. Experimental Gerontology. 48 (10), 1107-1119 (2013).
- Cheong, H., Nair, U., Geng, J., Klionsky, D. J. The Atg1 kinase complex is involved in the regulation of protein recruitment to initiate sequestering vesicle formation for nonspecific autophagy in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 19 (2), 668-681 (2008).
- Matsuura, A., Tsukada, M., Wada, Y., Ohsumi, Y. Apg1p, a novel protein kinase required for the autophagic process in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 192 (2), 245-250 (1997).
- Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nucleic Acids Research. 40, 700-705 (2012).
- Engel, S. R., et al. The reference genome sequence of Saccharomyces cerevisiae: then and now. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (3), 389-398 (2014).
- Imai, S. I., Armstrong, C. M., Kaeberlein, M., Guarente, L. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase. Nature. 403 (6771), 795-800 (2000).
- Sampaio-Marques, B., et al. SNCA (α-synuclein)-induced toxicity in yeast cells is dependent on Sir2-mediated mitophagy. Autophagy. 8 (10), 1494-1509 (2012).
- Nagalakshmi, U., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320 (5881), 1344-1349 (2008).
- De Boer, C. G., Hughes, T. R. YeTFaSCo: a database of evaluated yeast transcription factor sequence specificities. Nucleic Acids Research. 40, 169-179 (2012).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064 (2012).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. . Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
- Salvi, S., et al. Serum and plasma copy number detection using real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (130), e56502 (2017).
- McIsaac, R. S., et al. Visualization and analysis of mRNA molecules using fluorescence in situ hybridization in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (76), e50382 (2013).
- Mirisola, M. G., Braun, R. J., Petranovic, D. Approaches to study yeast cell aging and death. FEMS Yeast Research. 14 (1), 109-118 (2014).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
- Lin, S. J., Guarente, L. Nicotinamide adenine dinucleotide, a metabolic regulator of transcription, longevity and disease. Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 241-246 (2003).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 122 (1), 19-27 (1989).
- Romanos, M. A., Scorer, C. A., Clare, J. J. Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast. 8 (6), 423-488 (1992).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
- DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
- Arnone, J. T. Genomic Considerations for the Modification of Saccharomyces cerevisiae for Biofuel and Metabolite Biosynthesis. Microorganisms. 8 (3), (2020).
- Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells. Journal of Visualized Experiments. (27), e1156 (2009).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (28), e1209 (2009).
- Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (78), e50143 (2013).
