糖精中遗传链接调控时间寿命的抑制 器屏幕
Summary
这里是一个协议，通过增加的拷贝数抑制器屏幕在 糖精中识别遗传相互作用。这种方法允许研究人员识别、克隆和测试短寿命酵母突变体中的抑制器。我们测试S SIR2拷贝数 增加对自 噬空突变体寿命的影响。
Abstract
衰老是生物体正常生物过程的由时间依赖性恶化，增加了死亡的概率。许多遗传因素导致正常老化过程的改变。这些因素以复杂的方式相交，许多生物体中发现并保存的大量有据可查的联系就证明了这一点。这些研究大多数集中在功能丧失，空突变体，允许快速筛选许多基因同时。有少得多的工作，专注于描述在这个过程中，基因过度表达的作用。在目前的工作中，我们提出了一种直接的方法，用于识别和克隆萌 芽酵母中的基因，用于抑制许多遗传背景中见的短期寿命表型的研究。该协议旨在为来自各种背景和不同学术阶段的研究人员提供访问。 SIR2 基因编码为组蛋白去乙酰酶，在pRS315载体中被选为克隆基因，因为关于它对时间寿命的影响有相互矛盾的报道。 SIR2 在自噬中也起着一定的作用，当通过删除多个基因（包括转录因子 ATG1）来破坏时，这种作用会中断。作为原理证明，我们克隆 SROR2基因， 对自噬缺陷 atg1+ 突变体的缩短寿命表型特征进行抑制器筛查，并将其与异源野生型遗传背景进行比较。
Introduction
衰老是无数生物过程中依赖时间的完整性丧失，最终增加了机体死亡的概率。衰老对于所有物种来说几乎是不可避免的。在细胞水平上，有几个与衰老相关的特征特征，包括：基因组不稳定、表观遗传改变、蛋白质组功能丧失、线粒体功能障碍、去调节的营养感应、细胞衰老和端粒减员1,，2。1在单细胞生物，如酵母，这导致复制潜力和时间寿命的寿命,3，4的减少。这些细胞变化表现在更复杂的生物体，如人类，包括癌症，心力衰竭，神经退化，糖尿病和骨质疏松症5，6，76,的病理学。5尽管衰老过程有许多复杂性，但在这一过程的不同生物体8、9、10之间，9,这些分子特征是保存的。识别这些通路在老化期间的变化导致意识到，他们可以通过生活方式的改变操纵 – 饮食限制显示，大大延长了许多生物体11的寿命。这些路径以复杂的方式相互融合和相交，并相互相交。这些相互作用的阐明和表征为延长寿命和健康跨度12、13、14,13的治疗干预提供了潜力。
通过使用更简单的模型生物体（包括萌芽酵母、糖精糖15、16）,等，保护衰老的分子基础，可以对过程背后的遗传相互作用进行功能解剖。有两种既定的老化类型，以萌芽酵母为模型：按时间顺序测量（按时间顺序排列的寿命，CLS）和复制老化（复制寿命，RLS）17。按时间顺序排列的老化度量是细胞在非分裂状态下生存的时间量。这类似于在G0中度过大部分生命的细胞中的衰老，如神经元4。或者，复制寿命是单元格在耗尽前可以划分的次数，并且是线状活性细胞类型（例如，单元格可以具有的子细胞数）的模型 18。
这种方法的总体目标是提出一个协议，允许使用 S.cerevisiae对衰老的遗传学进行功能解剖。虽然许多研究人员进行了许多优秀的研究，这些研究导致了我们目前的理解，但初露头角的研究人员在学术生涯的早期就为老龄化领域做出了贡献。我们提出了一个明确的方法，使研究人员能够进一步推进老龄化领域。该协议旨在通过提供制定和测试自己新颖假设的必要工具，为所有研究人员提供访问，无论其学术生涯的阶段如何。我们的方法的优点是，这是一种具有成本效益的方法，无论机构如何，所有研究人员都很容易获得这种方法，而且不需要某些协议19所需的昂贵、专门的设备。有几种不同的方法来设计这种类型的屏幕，在这项工作中概述的方法是特别适合筛选非基本基因的空突变体，显示时间寿命严重缩短相比，同源野生型酵母菌株。
作为我们的原则证明，我们克隆了SR2，一种被报告为在过度表达时同时表现出扩展和缩短的CLS的奈氨酸二乙酰酶。SIR2过度表达最近被发现增加了酿酒酵母中的CLS;然而，几个团体报告说，SIR2和CLS扩展之间没有联系，其作用在20，21，22,21,的特征下。由于文献中的这些相互矛盾的报告，我们选择这个基因来添加独立的研究，以帮助澄清SR2在时间老化中的作用，如果有任何。此外，增加SER2同源的拷贝数延长了线虫模型系统23的寿命。
自噬是一种细胞内降解系统，向叶酸体24提供细胞细胞因子，如蛋白质和细胞器。自噬通过它的作用，在降解受损的蛋白质和细胞器，以保持细胞平衡25，与长寿紧密相连。自噬的诱导取决于协调许多基因的表达，而 ATG1基因的删除导致萌芽酵母26中的异常短的CLS。ATG1代码为蛋白质丝氨酸/链氨酸激酶，在自噬和细胞质到囊肿（真菌体体等效物）路径27，28中，囊泡形成是必需的。在这里，我们提出增加复制数字屏幕的方法，测试增加的 SIR2拷贝对野生类型和atg1-null 背景的 CLS效果。这种方法特别适用于主要为本科院校的初级研究人员和研究小组，其中许多为在科学领域代表性不足、资源有限的社区服务。
Protocol
Representative Results
Discussion
揭开衰老的遗传学是一个困难的挑战，有许多进一步研究的机会，有可能产生对存在的复杂相互作用的重要见解。有许多方法，允许迅速生成功能丧失突变体的研究酵母45，46的空菌株。这种方法提供了一种直接的方法，用于识别和克隆基因到pRS315载体上，用于过度表达抑制器的研究。这种方法的一个优点是，这允许从稳定的载体适度过度表达，这可以?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
James T. Arnone 感谢 2017 年和 2018 年威廉 ·帕特森大学重组 DNA 技术课程中学生的支持，他们自立时参与该项目，但其努力没有跨过作者的门槛：克里斯托弗·安蒂诺、胡安·博特罗、约瑟芬·博赞、布伦达·卡拉帕、布伦达·古巴斯、海特洛夫·埃塞尔·达齐、伊尔文·加马拉、珍贵的吉夫特·伊西博尔， 韦恩 · 科、纳尔逊 · 梅佳、赫克托 · 莫托拉、拉比亚 · 纳兹、阿卜杜拉 · 奥德、 珍珠 · 帕贡塔兰、丹尼尔 · 拉扎埃、加布里埃拉 · 校长、艾达 · 肖诺和马修 · 索。你们是伟大的科学家，我想念你们！
作者感谢威廉·帕特森大学教学和研究技术公司给予他们帮助的宝贵支持：格雷格·马蒂森、彼得·卡纳罗齐、罗布·迈耶、但丁·波泰拉和亨利·海尼特什。作者还要感谢艺术学支助教务长办公室、院长办公室和科学与健康学院研究中心对这项工作的支持，以及生物学系对该项目的支持。
Materials
| Fungal/Bacterial DNA kit | Zymo Research | D6005 | |
| HindIIIHF enzyme | New England Biolabs | R3104S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Plasmid miniprep kit | Qiagen | 12123 | |
| SacII enzyme | New England Biolabs | R0157S | |
| Salmon sperm DNA | Thermofisher | AM9680 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S |
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