Uno schermo soppressore per la caratterizzazione dei collegamenti genetici che regolano la durata cronologica in Saccharomyces cerevisiae

Summary

Ecco un protocollo per identificare le interazioni genetiche attraverso uno schermo soppressore numero di copie aumentato in Saccharomyces cerevisiae. Questo metodo consente ai ricercatori di identificare, clonare e testare i soppressori in mutanti di lievito di breve durata. Testiamo l’effetto dell’aumento del numero di copie di SIR2 sulla durata della vita in un mutante nullo autofagi.

Abstract

L’invecchiamento è il deterioramento dipendente dal tempo dei normali processi biologici di un organismo che aumenta la probabilità di morte. Molti fattori genetici contribuiscono alle alterazioni nel normale processo di invecchiamento. Questi fattori si intersecano in modo complesso, come dimostra la ricchezza di collegamenti documentati identificati e conservati in molti organismi. La maggior parte di questi studi si concentra sulla perdita di funzione, mutanti nulli che consentono lo screening rapido di molti geni contemporaneamente. C’è molto meno lavoro che si concentra sulla caratterizzazione del ruolo che sovraespressione di un gene in questo processo. Nel presente lavoro, presentiamo una metodologia semplice per identificare e clonare i geni nel lievito in erba, Saccharomyces cerevisiae, per lo studio nella soppressione del fenotipo cronologico della durata della vita di breve durata visto in molti background genetici. Questo protocollo è progettato per essere accessibile ai ricercatori provenienti da un’ampia varietà di background e in varie fasi accademiche. Il gene SIR2, che codifica per una deacetilase istonea, è stato selezionato per la clonazione nel vettore pRS315, in quanto ci sono state relazioni contrastanti sul suo effetto sulla durata cronologica della vita. SIR2 svolge anche un ruolo nell’autofagia, che si traduce quando interrotto attraverso la cancellazione di diversi geni, tra cui il fattore di trascrizione ATG1. Come prova di principio, clonamo il gene SIR2 per eseguire uno schermo soppressore sul fenotipo abbreviato della durata della vita caratteristica del mutante atg1, un mutante carente di autofagia, e lo confrontiamo con un background genetico altrimenti isogenico di tipo selvaggio.

Introduction

L’invecchiamento è la perdita di integrità dipendente dal tempo in una miriade di processi biologici che aumenta in ultima analisi la probabilità di morte dell’organismo. L’invecchiamento è quasi inevitabile per tutte le specie. A livello cellulare ci sono diversi segni distintivi ben caratterizzati che sono associati con l’invecchiamento, tra cui: instabilità genomica, alterazioni epigenetiche, perdita di proteostasi, disfunzione mitocondriale, rilevamento dei nutrienti deregolamentato, senescenza cellulare, e logoramento telomero^1,2. Negli organismi a singolo cellula, come i lieviti, questo porta ad una riduzione del potenziale replicativo e della durata cronologica^3,4. Questi cambiamenti cellulari si manifestano in organismi più complessi, come gli esseri umani, come patologie che includono tumori, insufficienza cardiaca, neurodegenerazione, diabete e osteoporosi^5,6,7. Nonostante le molte complessità che caratterizzano il processo di invecchiamento, c’è la conservazione di questi segni molecolari alla base di questo processo attraverso organismi ampiamente divergenti^8,9,10. L’identificazione di alterazioni a questi percorsi durante l’invecchiamento ha portato alla consapevolezza che possono essere manipolati attraverso cambiamenti di stile di vita – restrizione dietetica è indicato per estendere sostanzialmente la durata della vita in molti^{organismi 11}. Questi percorsi convergono e si intersecano tra loro e molti altri percorsi, in modi complessi. Il chiarimento e la caratterizzazione di queste interazioni offre il potenziale per interventi terapeutici per prolungare la durata della vita e la durata^{della salute 12,13,14}.

La conservazione delle basi molecolari dell’invecchiamento consente la dissezione funzionale delle interazioni genetiche alla base del processo attraverso l’uso di organismi modello più semplici – anche nel lievito in erba, Saccharomyces cerevisiae^15,16. Esistono due tipi consolidati di invecchiamento modellati da lieviti in erba: l’invecchiamento cronologico (la durata cronologica della vita, CLS) e l’invecchiamento replicativo (la durata replicativa, RLS)¹⁷. L’invecchiamento cronologico misura la quantità di tempo in cui una cella può sopravvivere in uno stato non diviso. Questo è analogo all’invecchiamento che si vede nelle cellule che trascorrono la maggior parte della loro vita in G₀, come i neuroni⁴. In alternativa, la durata replicativa è il numero di volte in cui una cella può dividersi prima dell’esaurimento ed è un modello per i tipi di cellule mitoticamente attive (ad esempio, il numero di celle figlia che una cella può^{avere) 18}.

L’obiettivo generale di questo metodo è quello di presentare un protocollo che consente la dissezione funzionale della genetica dell’invecchiamento utilizzando S. cerevisiae. Mentre ci sono stati molti studi eccellenti eseguiti da molti ricercatori che hanno portato alla nostra attuale comprensione, ci sono molte opportunità disponibili per i ricercatori in erba per contribuire al campo di invecchiamento fin dall’inizio della loro carriera accademica. Vi presentiamo una metodologia chiara che permetterà ai ricercatori di far progredire ulteriormente il campo dell’invecchiamento. Questo protocollo è progettato per essere accessibile a tutti i ricercatori indipendentemente dalla fase della loro carriera accademica, fornendo gli strumenti necessari per formulare e testare le proprie nuove ipotesi. Il vantaggio del nostro approccio è che questo è un metodo conveniente facilmente accessibile a tutti i ricercatori indipendentemente dall’istituzione – e non richiede costose attrezzature specializzate necessarie per alcuni protocolli¹⁹. Ci sono diversi modi per progettare questo tipo di schermo, l’approccio delineato in questo lavoro è particolarmente sussbile per lo screening di mutanti nulli di geni non essenziali che presentano una grave riduzione della durata della vita cronologica rispetto a un ceppo isogenico di lievito di tipo selvatico.

Come prova di principio, cloniamo SIR2, una deacetilase lisina riportata come esibire sia una CLS estesa che una CLS abbreviata quando sovraespressa. Sir2 sovraespressione è stato recentemente trovato per aumentare CLS nei lieviti di vinificazione; tuttavia, diversi gruppi non hanno segnalato alcun collegamento tra SIR2 e l’estensione CLS, lasciando il suo ruolo^{sotto la caratterizzata 20,21,22}. A causa di queste relazioni contrastanti nella letteratura, abbiamo selezionato questo gene per aggiungere una ricerca indipendente per aiutare a chiarire il ruolo di SIR2 nell’invecchiamento cronologico, se presente. Inoltre, l’aumento del numero di copie di un homologue SIR2 estende la durata in un sistema di modello di worm nematode²³.

L’autofagia è un sistema di degradazione intracellulare per fornire prodotti citosolici, come proteine e organelli, al lisosoma²⁴. L’autofagia è intimamente legata alla longevità attraverso il suo ruolo nel degradare le proteine e gli organelli danneggiati per mantenere l’omeostasi cellulare²⁵. L’induzione dell’autofagia dipende dall’orchestrazione dell’espressione di molti geni, e la cancellazione del gene ATG1 si traduce in una CLS anormalmente breve nel lievito in^{erba 26}. Codici ATG1 per una proteina serina/treonina chinasi che è necessaria per la formazione di vescicole in autofagia e il cytoplasma-a-vacuole (l’equivalente lisosomiale fungino)^{percorso 27,28}. Qui, presentiamo il nostro metodo per una schermata di numero di copia aumentata, testando l’effetto di una maggiore copia DI SIR2 su CLS in un tipo selvaggio e uno sfondo atg1-null. Questo metodo è particolarmente sussbile per i giovani ricercatori e gruppi di ricerca presso le istituzioni principalmente universitarie, molte delle quali servono comunità sottorappresentate nelle scienze e hanno risorse limitate.

Protocol

1. Identificare potenziali interazioni genetiche per lo screening Identificare il background genetico(i) per la caratterizzazione, che si traduce in una durata di vita cronologica (CLS) anormalmente breve in Saccharomyces cerevisiae utilizzando il saccharomyces Genome Database (L’SGD, https://www.yeastgenome.org29,30), che compila informazioni fenotipo note per questo organismo. Selezionare la scheda Funzione d…

Representative Results

Poiché ci sono rapporti contrastanti sul ruolo di SIR2 durante l’invecchiamento, abbiamo scelto questo gene per lo studio come un potenziale soppressore del fenotipo CLS26del mutante atg1 . Il ruolo di SIR2 è alquanto controverso, con rapporti contrastanti sul suo ruolo nell’estensione di CLS, tuttavia è stato chiaramente collegato ad un aumento di CLS in almeno uno sfondo di lievito, con un ruolo sia nell’autofagia che nella mitofagia22,<…

Discussion

Svelare la genetica dell’invecchiamento è una sfida difficile, con molte opportunità per ulteriori studi che possono potenzialmente fornire informazioni significative sulle complesse interazioni esistenti. Ci sono molti metodi che consentono la rapida generazione di mutanti in perdita di funzione per lo studio di ceppi nulli di lievito^45,46. Questo metodo presenta un approccio semplice per identificare e clonare i geni sul vettore pRS315 per gli studi di soppre…

Materials

Fungal/Bacterial DNA kit	Zymo Research	D6005
HindIIIHF enzyme	New England Biolabs	R3104S
Phusion High-Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S
Plasmid miniprep kit	Qiagen	12123
SacII enzyme	New England Biolabs	R0157S
Salmon sperm DNA	Thermofisher	AM9680
T4 DNA ligase	New England Biolabs	M0202S