サッカロミセス・セレビシエにおける年代の寿命を調節する遺伝的リンクの特性評価のためのサプレッサースクリーン
Summary
ここでは、 サッカロミセスセレビシエの増加したコピー数サプレッサー画面を介して遺伝的相互作用を識別するためのプロトコルです。この方法により、研究者は短命酵母変異体のサプレッサーを同定、クローン化、および試験することができます。オートファジーヌル変異体における SIR2 のコピー数増加が寿命に及ぼす影響を試験する。
Abstract
老化は、死の確率を高める生物の正常な生物学的プロセスの時間依存性の悪化である。多くの遺伝的要因は、通常の老化プロセスの変化に寄与する。これらの要因は、多くの生物で同定され保存された豊富な文書化されたリンクによって証明されるように、複雑な方法で交差します。これらの研究のほとんどは、多くの遺伝子を同時に迅速にスクリーニングすることを可能にする機能喪失、ヌル突然変異体に焦点を当てています。このプロセスにおける遺伝子の過剰発現の役割を特徴付けすることに焦点を当てた作業ははるかに少ないです。本研究では、多くの遺伝的背景に見られる短命の年代順寿命表現型の抑制に関する研究のために、出芽酵母サッ カロミセス・セレビシエの遺伝子を同定し、クローン化するための簡単な方法論を提示する。このプロトコルは、さまざまな背景から、様々な学問段階で研究者がアクセスできるように設計されています。ヒストンデアセチラーゼをコードする SIR2 遺伝子は、時系列寿命への影響に関する矛盾する報告があったため、pRS315ベクターのクローニングに選択された。 SIR2 はまた、オートファジーにおいて役割を果たし、転写因子 ATG1を含む複数の遺伝子の欠失を介して破壊された場合に生じる。原理の証明として 、SIR2 遺伝子をクローン化し、オートファジー欠損型 atg1Δ 変異体の短寿命表現型特性にサプレッサースクリーンを実行し、それ以外のアイソジェニックで野生型の遺伝的背景と比較する。
Introduction
老化は、最終的に生物死亡の確率を高める無数の生物学的プロセスにおける誠実さの時間依存的喪失である。老化は、すべての種のためにほぼ避けられません。細胞レベルでは、ゲノム不安定性、エピジェネティック変化、プロテオスタシスの喪失、ミトコンドリア機能不全、規制緩和された栄養センシング、細胞老化、およびテロメア消耗11、22など、老化に関連するいくつかの特徴があります。酵母のような単細胞生物では、これは複製電位および年代的寿命33、44の減少をもたらす。これらの細胞変化は、癌、心不全、神経変性、糖尿病、骨粗鬆症55、6、76,を含む病理として、ヒトのようなより複雑な生物に現れる。老化のプロセスを特徴づける多くの複雑さにもかかわらず、広く発散する生物,8、9、109に渡ってこのプロセスの根8底にあるこれらの分子的特徴の保全がある。10老化時にこれらの経路の変化を同定すると、生活習慣の変化によって操作できることが実現した- 食事制限は、多くの生物の寿命を大幅に延ばすことを示している11.これらの経路は、複雑な方法で互いに収束し、交差し、他の多くの経路。これらの相互作用の解明と特徴付けは、寿命と健康寿命を延ばすために治療介入の可能性を提供します12,,13,,14.
老化の分子基盤の保全は、より単純なモデル生物の使用を通じてプロセスの基礎となる遺伝的相互作用の機能的解剖を可能にする – 出芽酵母、サッカロマイセスcerevisiae15、16,16を含む。出芽酵母によってモデル化された老化の2つの確立されたタイプがあります:時系列老化(時系列寿命、CLS)および複製老化(複製寿命、RLS)17。時系列のエージングは、細胞が非分割状態で生き残ることができる時間を測定します。これは、細胞4などG0で人生の大半を過ごす細胞に見られる老化に似ています。あるいは、複製寿命は、細胞が枯渇前に分裂できる回数であり、有糸分裂的に活性な細胞型(例えば、細胞が有することができるドーター細胞の数)18である。
この方法の全体的な目標は 、S.cerevisiaeを使用して老化の遺伝学の機能的解剖を可能にするプロトコルを提示することです。多くの研究者が多くの優れた研究を行い、現在の理解を得ていますが、新進研究者が学業の早い段階から高齢化に貢献する機会は数多く残っています。研究者が老化の分野をさらに進めることを可能にする明確な方法論を提示します。このプロトコルは、独自の新しい仮説を策定し、テストするために必要なツールを提供することにより、彼らの学術的なキャリアの段階に関係なく、すべての研究者のためにアクセスできるように設計されています。私たちのアプローチの利点は、これは、機関に関係なく、すべての研究者が容易にアクセスできる費用対効果の高い方法であるということです – そして、いくつかのプロトコル19に必要な高価な、特殊な機器を必要としません。このタイプのスクリーンを設計する方法はいくつかありますが、この研究で概説されているアプローチは、酵母の等原性野生型株と比較して時系列寿命の著しい減少を示す非本質的遺伝子のヌル突然変異体をスクリーニングするのに特に適しています。
我々の原理証明として、我々はSIR2、リジンデアセチラーゼを過剰発現時に延長および短縮CLSの両方を示すと報告したクローンを作成する。SIR2過剰発現は最近、ワイン造酵母のCLSを増加させることが判明した。しかし、いくつかのグループはSIR2とCLS拡張間のリンクを報告していない、 特徴付けられる20、21,、22の下でその役割を残す 。文献のこれらの矛盾する報告のために、我々は、ある場合、時系列老化におけるSIR2の役割を明確にするために独立した研究を追加するために、この遺伝子を選択しました。さらに、SIR2ホモローグのコピー数を増やすと、線虫モデルシステム23の寿命が延びる。
オートファジーは、細胞内分解系であり、タンパク質やオルガネラなどの細胞質製品をリソソーム24に送達する。オートファジーは、細胞の恒常性を維持するために損傷したタンパク質およびオルガネラを分解する役割を通じて長寿と密接に結びついている。オートファジーの誘導は、多くの遺伝子の発現を調整することに依存し、そしてATG1遺伝子の欠失は出芽酵母26において異常に短いCLSをもたらす。オートファジーおよび細胞質-液胞(真菌リソソーム等価)経路27,28,28における小胞形成に必要なタンパク質セリン/スレオニンキナーゼに対するATG1コード。ここでは、コピー数の増加画面のメソッドを紹介し、野生型のCLSおよびatg1-nullバックグラウンドでSIR2コピーが増加した場合の効果をテストします。この方法は、主に学部の機関の若手研究者や研究グループに特に適しています, その多くは、科学で過小評価され、限られたリソースを持っているコミュニティにサービスを提供しています.
Protocol
Representative Results
Discussion
老化の遺伝学を解明することは困難な課題であり、存在する複雑な相互作用に関する重要な洞察を得ることができるさらなる研究の機会が多い。酵母45,46,46のヌル株の研究のための機能喪失変異体の迅速な生成を可能にする多くの方法がある。この方法は、過剰発現サプレッサー研究のためにpRS315ベクター上の遺伝子を同定し、クローン化するため…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ジェームズ・T・アーノーネは、ウィリアム・パターソン大学の2017年と2018年の組換えDNA技術コースの学生の支援を認めたいが、その努力は著者のしきい値を超えなかった:クリストファー・アンディーノ、フアン・ボテロ、ジョセフィーヌ・ボザン、ブレンダ・カルパ、ブレンダ・キューバズ、ヘッドラブ・エッセル・ダッセル、ウェイン・コ、ネルソン・メヒア、ヘクター・モットーラ、ラビア・ナズ、アブドゥッラー・オデ、パール・パグンタラン、ダニエル・ラザエ、ガブリエラ・レクター、アイーダ・ショノ、マシュー・ソー。あなたは偉大な科学者であり、私は皆さんがいなくて寂しいです!
著者らは、ウィリアム・パターソン大学の指導研究技術の支援(グレッグ・マティソン、ピーター・カンナロッツィ、ロブ・マイヤー、ダンテ・ポルテラ、ヘンリー・ハイニッシュ)の貴重な支援を認めたいと考えています。著者らはまた、ARTサポートのためのプロボストのオフィス、学部長と科学と健康の大学研究センターは、この仕事のサポート、およびこのプロジェクトをサポートするための生物学部門を認めたいと思います。
Materials
| Fungal/Bacterial DNA kit | Zymo Research | D6005 | |
| HindIIIHF enzyme | New England Biolabs | R3104S | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530S | |
| Plasmid miniprep kit | Qiagen | 12123 | |
| SacII enzyme | New England Biolabs | R0157S | |
| Salmon sperm DNA | Thermofisher | AM9680 | |
| T4 DNA ligase | New England Biolabs | M0202S |
References
- López-Otín, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Kenyon, C. The genetics of ageing. Nature. 464 (7288), 504-512 (2010).
- Petralia, R. S., Mattson, M. P., Yao, P. J. Aging and longevity in the simplest animals and the quest for immortality. Ageing Research Reviews. 16, 66-82 (2014).
- Longo, V. D., Fabrizio, P. . Aging Research in Yeast. , 101-121 (2011).
- Campisi, J. Aging, cellular senescence, and cancer. Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).
- Galkin, F., Zhang, B., Dmitriev, S. E., Gladyshev, V. N. Reversibility of irreversible aging. Ageing Research Reviews. 49, 104-114 (2019).
- Khan, S. S., Singer, B. D., Vaughan, D. E. Molecular and physiological manifestations and measurement of aging in humans. Aging Cell. 16 (4), 624-633 (2017).
- Riera, C. E., Merkwirth, C., De Magalhaes Filho, C. D., Dillin, A. Signaling networks determining life span. Annual Review of Biochemistry. 85, 35-64 (2016).
- Powers, R. W., Kaeberlein, M., Caldwell, S. D., Kennedy, B. K., Fields, S. Extension of chronological life span in yeast by decreased TOR pathway signaling. Genes & Development. 20 (2), 174-184 (2006).
- Lapierre, L. R., Hansen, M. Lessons from C. elegans: signaling pathways for longevity. Trends in Endocrinology & Metabolism. 23 (12), 637-644 (2012).
- Fontana, L., Partridge, L., Longo, V. D. Extending healthy life span-from yeast to humans. Science. 328 (5976), 321-326 (2010).
- Houtkooper, R. H., Pirinen, E., Auwerx, J. Sirtuins as regulators of metabolism and healthspan. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (4), 225-238 (2012).
- Bitto, A., et al. Transient rapamycin treatment can increase lifespan and healthspan in middle-aged mice. elife. 5, 16351 (2016).
- Fang, E. F., et al. NAD+ replenishment improves lifespan and healthspan in ataxia telangiectasia models via mitophagy and DNA repair. Cell Metabolism. 24 (4), 566-581 (2016).
- Kaeberlein, M., Kennedy, B. K. Large-scale identification in yeast of conserved ageing genes. Mechanisms of Ageing and Development. 126 (1), 17-21 (2005).
- Fabrizio, P., et al. Genome-wide screen in Saccharomyces cerevisiae identifies vacuolar protein sorting, autophagy, biosynthetic, and tRNA methylation genes involved in life span regulation. PLoS Genetics. 6 (7), (2010).
- Longo, V. D., Shadel, G. S., Kaeberlein, M., Kennedy, B. Replicative and chronological aging in Saccharomyces cerevisiae. Cell Metabolism. 16 (1), 18-31 (2012).
- He, C., Zhou, C., Kennedy, B. K. The yeast replicative aging model. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. 1864 (9), 2690-2696 (2018).
- Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Huberts, D. H., Lee, L. P., Heinemann, M. Whole lifespan microscopic observation of budding yeast aging through a microfluidic dissection platform. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (13), 4916-4920 (2012).
- Fabrizio, P., Longo, V. D. The chronological life span of Saccharomyces cerevisiae. Aging Cell. 2 (2), 73-81 (2003).
- Smith, J., Daniel, L., McClure, J. M., Matecic, M., Smith, J. S. Calorie restriction extends the chronological lifespan of Saccharomyces cerevisiae independently of the Sirtuins. Aging Cell. 6 (5), 649-662 (2007).
- Orozco, H., Matallana, E., Aranda, A. Genetic manipulation of longevity-related genes as a tool to regulate yeast life span and metabolite production during winemaking. Microbial Cell Factories. 12 (1), 1 (2013).
- Tissenbaum, H. A., Guarente, L. Increased dosage of a sir-2 gene extends lifespan in Caenorhabditis elegans. Nature. 410 (6825), 227-230 (2001).
- Huang, W. P., Klionsky, D. J. Autophagy in yeast: a review of the molecular machinery. Cell Structure and Function. 27 (6), 409-420 (2002).
- Barbosa, M. C., Grosso, R. A., Fader, C. M. Hallmarks of aging: an autophagic perspective. Frontiers in Endocrinology. 9, 790 (2019).
- Aris, J. P., et al. Autophagy and leucine promote chronological longevity and respiration proficiency during calorie restriction in yeast. Experimental Gerontology. 48 (10), 1107-1119 (2013).
- Cheong, H., Nair, U., Geng, J., Klionsky, D. J. The Atg1 kinase complex is involved in the regulation of protein recruitment to initiate sequestering vesicle formation for nonspecific autophagy in Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 19 (2), 668-681 (2008).
- Matsuura, A., Tsukada, M., Wada, Y., Ohsumi, Y. Apg1p, a novel protein kinase required for the autophagic process in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 192 (2), 245-250 (1997).
- Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nucleic Acids Research. 40, 700-705 (2012).
- Engel, S. R., et al. The reference genome sequence of Saccharomyces cerevisiae: then and now. G3: Genes, Genomes, Genetics. 4 (3), 389-398 (2014).
- Imai, S. I., Armstrong, C. M., Kaeberlein, M., Guarente, L. Transcriptional silencing and longevity protein Sir2 is an NAD-dependent histone deacetylase. Nature. 403 (6771), 795-800 (2000).
- Sampaio-Marques, B., et al. SNCA (α-synuclein)-induced toxicity in yeast cells is dependent on Sir2-mediated mitophagy. Autophagy. 8 (10), 1494-1509 (2012).
- Nagalakshmi, U., et al. The transcriptional landscape of the yeast genome defined by RNA sequencing. Science. 320 (5881), 1344-1349 (2008).
- De Boer, C. G., Hughes, T. R. YeTFaSCo: a database of evaluated yeast transcription factor sequence specificities. Nucleic Acids Research. 40, 169-179 (2012).
- Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. Journal of Visualized Experiments. (63), e3064 (2012).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. . Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
- Salvi, S., et al. Serum and plasma copy number detection using real-time PCR. Journal of Visualized Experiments. (130), e56502 (2017).
- McIsaac, R. S., et al. Visualization and analysis of mRNA molecules using fluorescence in situ hybridization in Saccharomyces cerevisiae. Journal of Visualized Experiments. (76), e50382 (2013).
- Mirisola, M. G., Braun, R. J., Petranovic, D. Approaches to study yeast cell aging and death. FEMS Yeast Research. 14 (1), 109-118 (2014).
- Ricardo, R., Phelan, K. Counting and determining the viability of cultured cells. Journal of Visualized Experiments. (16), e752 (2008).
- Lin, S. J., Guarente, L. Nicotinamide adenine dinucleotide, a metabolic regulator of transcription, longevity and disease. Current Opinion in Cell Biology. 15 (2), 241-246 (2003).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 122 (1), 19-27 (1989).
- Romanos, M. A., Scorer, C. A., Clare, J. J. Foreign gene expression in yeast: a review. Yeast. 8 (6), 423-488 (1992).
- Pfaffl, M. W. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT-PCR. Nucleic Acids Research. 29 (9), 45 (2001).
- Storici, F., Resnick, M. A. The delitto perfetto approach to in vivo site-directed mutagenesis and chromosome rearrangements with synthetic oligonucleotides in yeast. Methods in Enzymology. 409, 329-345 (2006).
- DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Research. 41 (7), 4336-4343 (2013).
- Arnone, J. T. Genomic Considerations for the Modification of Saccharomyces cerevisiae for Biofuel and Metabolite Biosynthesis. Microorganisms. 8 (3), (2020).
- Murakami, C., Kaeberlein, M. Quantifying yeast chronological life span by outgrowth of aged cells. Journal of Visualized Experiments. (27), e1156 (2009).
- Steffen, K. K., Kennedy, B. K., Kaeberlein, M. Measuring replicative life span in the budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (28), e1209 (2009).
- Huberts, D. H., Janssens, G. E., Lee, S. S., Vizcarra, I. A., Heinemann, M. Continuous high-resolution microscopic observation of replicative aging in budding yeast. Journal of Visualized Experiments. (78), e50143 (2013).
