이 프로토콜은 지문에 대한 접근 방식을 제시하고 질량 분석에 결합 된 포괄적 인 2 차원 가스 크로마토그래피에 의해 수집 된 다차원 데이터를 탐구합니다. 전용 패턴 인식 알고리즘(템플릿 매칭)은 엑스트라 버진 올리브 오일 휘발성 분수(즉, 화산술)에서 암호화된 화학 정보를 탐구하기 위해 적용됩니다.
데이터 처리 및 평가는 특히 질량 분석과 결합될 때 포괄적인 2차원 가스 크로마토그래피(GCxGC)의 중요한 단계입니다. 데이터에 암호화된 풍부한 정보는 매우 중요하지만 효율적으로 액세스하기 어려울 수 있습니다. 데이터 밀도와 복잡성은 긴 정교화 시간으로 이어질 수 있으며 분석가에 의존하는 힘든 절차가 필요합니다. 따라서 효과적이면서도 접근가능한 데이터 처리 도구는 일상적인 사용을 위해 실험실에서 이 고급 다차원 기술의 확산과 수용을 가능하게 하는 데 핵심적인 것입니다. 이 작품에 제시된 데이터 분석 프로토콜은 크로마토그래픽 지문 링 및 템플릿 매칭을 사용하여 복잡한 2차원 크로마토그램을 개별 화학 적 특징으로 고도로 자동화된 분해하여 개별 크로마토그램 내 및 크로마토그램 세트에 걸쳐 유익한 패턴을 선진적으로 인식한다는 목표를 달성합니다. 이 프로토콜은 개입이 거의 없는 높은 일관성과 신뢰성을 제공합니다. 동시에 다양한 요구 와 목표에 맞게 유연성과 용량을 제공하기 위해 사용자 정의 할 수있는 다양한 설정 및 제약 기능에서 분석가의 감독이 가능합니다. 템플릿 매칭은 엑스트라 버진 올리브 오일 volatilome을 탐구하는 강력한 접근 방식으로 여기에 표시됩니다. 피크의 교차 정렬은 알려진 대상뿐만 아니라 광범위한 응용 분야에 대한 특성화 전력을 크게 증가시키는 표적 화합물에 대해서도 수행됩니다. 예는 유사한 조건하에서 분석된 견본 세트에서 크로마토그래피 패턴의 분류 그리고 비교를 위한 성과를 입증하기 위하여 제시됩니다.
비행 시간 질량 분광 검출(GC×GC-TOF MS)과 결합된 포괄적인 2차원 가스 크로마토그래피는 오늘날 복잡한 시료1,2,3,4,5의화학적 특성화를 위한 가장 유익한 분석 접근법이다. GC×GC에서 컬럼은 제1차원(1D)컬럼에서 부품을 2차원(2D) 컬럼으로 재주입하기 전에 용출하는 변조기(예: 열 또는 밸브 기반 초점인터페이스)에 의해 연재되고 인터페이스됩니다. 이 작업은 일반적으로 0.5-8 s 사이로 고정 된 변조 기간(PM)내에서 수행됩니다. 열 변조에 의해, 프로세스는 전체 분리 전력에 대한 몇 가지 이점을 가진 용출 밴드의 냉동 트래핑 및 초점을 포함한다.
GC×GC는 2차원 분리 기술이지만 프로세스는 순차적 데이터 값을 생성합니다. 검출기 아날로그-디지털(A/D) 컨버터는 특정 주파수에서 크로마토그래피 신호 출력을 얻습니다. 그런 다음 데이터는 디지털화된 데이터뿐만 아니라 관련 메타데이터(데이터에 대한 정보)를 포함하는 특정 독점 형식으로 저장됩니다. GC×GC 시스템에 사용되는 A/D 컨버터는 크로마토그래피 신호의 강도를 두 분석 치수에서 시간의 함수로서 디지털 번호(DN)로 매핑하는 데 도움이 됩니다. 단일 채널 검출기(예: 화염 이온화 검출기(FID), 전자 포획 검출기(ECD), 유황 케미닌 검출기(SCD) 등)은 샘플링 시간당 단일 값을 생성하는 반면, 멀티채널 검출기(예를 들어, 질량 분광 검출기(MS))는 샘플링 시간에 따라 여러 값(일반적으로 스펙트럼 범위 이상)을 생성합니다.
2D데이터를 시각화하려면 단일 변조 기간(또는 주기) 데이터 값을 픽셀 열(검출기 이벤트에 대응하는 그림 요소)으로 래스터레이션으로 시작합니다. 좌표(Y축, 아래쪽에서 위에서) 2D분리 시간이 시각화됩니다. 픽셀 열은 복근(X축, 왼쪽에서 오른쪽)이 1D분리 시간을 보고하도록 순차적으로 처리됩니다. 이 순서는 오른손잡이 카르테시안 좌표 시스템에 2D데이터를 제공하며, 1D보존 은 배열에 대한 첫 번째 인덱스로 제공됩니다.
2D크로마토그램의 데이터 처리는 원시 데이터보다 더 높은 수준의 정보에 액세스할 수 있으므로 2D피크 감지, 피크 식별, 정량 적 분석을 위한 응답 데이터 추출 및 교차 비교 분석을 가능하게 합니다.
2D피크 패턴은 효과적인 교차 비교 분석을 위한 미누티아 기능으로 샘플의 고유한 지문 및 검출된 화합물로 처리될 수 있습니다. 템플릿 기반 지문6,7로알려진 이 접근 방식은 생체 인식 지문6에서영감을 받았습니다. 자동 생체 인식 지문 검증 시스템은 사실, 독특한 손가락 특성에 의존: 능선 분기 및 엔딩, 국산화 및 잉크 노출 또는 상세한 이미지에서 추출. 이러한 특성, 명명 된 minutiae 기능, 다음 사용 가능한 저장된템플릿과교차 일치8,9.
위에서 언급한 바와 같이, 모든 GC×GC 분리 패턴은 2차원 평면에 합리적으로 분포된 2D피크로 구성됩니다. 각 피크는 단일 분석기에 해당하며, 유익한 잠재력을 가지며, 비교 패턴 분석을 위한 단일 기능으로 취급될 수 있습니다.
여기서는 GC×GC-TOF MS의 화학 지문에 대한 효과적인 접근법이 탠덤 이온화를 특징으로 합니다. 목표는 크로마토그램 세트의 기능을 포괄적이고 정량적으로 카탈로그화하는 것입니다.
피크 기능 접근 방식을 사용하는 기존 상용 소프트웨어 또는 사내루틴(10)및11에 비해 템플릿 기반 지문은 높은 특이성, 효율성 및 제한된 계산 시간을 특징으로합니다. 또한, 다른 계측물 또는 장시간 프레임 연구에서 획득한 크로마토그램과 같이 심각하게 잘못 정렬된 크로마토그램 사이의 미누티아 기능(즉, 2D피크)의 교차 정렬을 가능하게 하는 본질적인 유연성을 갖는다12,13,14.
제안된 방법의 기본 작업은 독자에게 2D패턴의 복잡성과 정보 력을 잘 이해하도록 안내하기 위해 간략하게 설명된다. 그런 다음 계측기 출력 데이터 매트릭스를 탐색하여 화학 적 식별이 수행되고 2 차원 공간 위에 위치한 표적 분석기로 알려져 있습니다. 그런 다음 대상 피크의 템플릿을 동일한 분석 배치 내에서 획득한 일련의 크로마토그램에 빌드되고 적용됩니다. 보존 시간, 스펙트럼 서명 및 응답(절대 및 상대적)과 관련된 메타데이터는 대상 피크의 재정렬 패턴에서 추출되고 샘플 집합의 조성 차이를 드러내도록 채택됩니다.
프로세스의 추가, 독특한 단계로, 결합 된 대상 및 대상 (UT) 지문은 또한 알려진 및 알 수없는 별문 모두에 지문 잠재력을 확장하기 위해 사전 표적 크로마토그램에 수행됩니다. 이 프로세스는 크게 자동화할 수 있는 포괄적인 비교 분석을 위한 UT 템플릿을 생성합니다.
최종 단계로, 이 방법은 높은 전자 이온화 에너지(70 및 12 eV)로 생성된 두 개의 병렬 검출기 신호에서 피처의 교차 정렬을 수행한다.
이 프로토콜은 단일 크로마토그램 또는 크로마토그램 세트의 분석을 지원하고 가변 크로마토그래피 및/또는 다중 검출기를 사용하여 매우 유연합니다. 여기서 프로토콜은 MS 라이브러리 및 검색 소프트웨어(재료 표 참조)에 결합된 상용 GC×GC 소프트웨어 제품군(재료 표참조)으로 시연됩니다. 필요한 도구 중 일부는 다른 소프트웨어에서 사용할 수 있으며 유사한 도구는 라이헨바흐와 동료15, 16,17,18,19에의해 문학의 설명에서 독립적으로 구현 될 수있다. 데모에 대한 원시 데이터는 저자의 실험실에서 실시 엑스트라 버진 올리브 (EVO) 오일에 대한 연구 연구에서 파생됩니다14. 특히, 이탈리아 EVO 오일의 휘발성 분수(즉, 화산질)는 헤드스페이스 고형 미세 추출(HS-SPME)에 의해 샘플링되고 GC×GC-TOF MS에 의해 분석되어 샘플의 품질 및 감각 적 자격을 위한 진단 지문을 포착한다. 샘플, 샘플링 조건 및 분석 설정에 대한 세부 정보는 재료 표에제공됩니다.
단계 1-6 크로마토그램의 사전 처리를 설명합니다. 단계 7-9 개별 크로마토그램의 처리 및 분석을 설명합니다. 10-12 단계는 교차 샘플 분석의 기초인 템플릿 생성 및 일치를 설명합니다. 13-16 단계는 UT 분석을 위한 14-16 단계와 함께 크로마토그램 집합에 프로토콜을 적용하는 것을 설명합니다.
GC×GC-TOF MS 데이터의 시각화는 포괄적인 2차원 분리에 의해 달성된 결과를 적절히 이해하기 위한 기본 단계입니다. 사용자 지정된 색화가 있는 이미지 플롯을 통해 분석가는 검출기 응답 차이를 인식하고 따라서 샘플 구성 요소의 차동 분포를 이해할 수 있습니다. 이 시각적 접근 방식은 크로마토그램의 해석과 정교화에 대한 분석가의 관점을 완전히 바꿉시킵니다. 이 첫 번째 단계는 한때 크로마토그래퍼가 이해하고 자신있게 사용했던 것으로, 추가 처리에 대한 새로운 관점을 열어줍니다.
데이터 처리의 또 다른 근본적인 측면은 단일 검출기 이벤트에 해당하는 모든 샘플 포인트에 대한 전체 데이터 매트릭스(즉, MS 스펙트럼 데이터 및 응답)에 대한 접근성입니다. 이러한 점에서 2D는단일 멸분해에 해당하는 검출기 이벤트의 수집이 중요한 단계를 나타낼 수 있도록 통합을 최대화합니다. 현재 프로토콜에서, 2D피크 검출은 분수령알고리즘(18)을 기반으로 하며, 일부 적응은 부분적인 동례 화합물의 경우 검출 민감도를 향상시킨다. 이 프로세스를 보다 구체적으로 만들려면 deconvolution을 수행해야 하며 보다 정교한 절차를 채택해야 합니다. 이는 MS 데이터에 대한 이온 피크 검출을 수행함으로써 가능합니다. 알고리즘은 데이터 어레이를 처리하고 스펙트럼 프로파일19,31을기반으로 단일 분석기의 응답을 격리합니다.
프로토콜의 중요하면서도 중요한 단계이며 GC×GC-MS 데이터 해석 프로세스는 분석자 식별과 관련이 있습니다. 8단계와 9단계에서 제안된 이 절차는 정통 표준을 가진 확인 분석이 없는 경우 분석가가 신중하게 수행해야 합니다. 자동화된 작업은 모든 상용 소프트웨어에서 사용할 수 있습니다. 여기에는 수집된 기준 스펙트럼(즉, 스펙트럼 라이브러리)에 대한 MS 스펙트럼 서명 유사성 평가와 한정자/정량화이온 간의 특성 비율 평가가 포함됩니다. 그러나 isomers의 식별을 모호하게 하기 위해서는 추가 확인 기준이 필요합니다. 프로토콜은 후보자 목록의 우선 순위를 지정하기 위해 선형 보존 인덱스의 채택을 제안합니다. 여기서 제한은 보존 데이터의 가용성과 일관성과 관련이 있습니다.
이 접근 방식을 고유하게 만드는 주요 특징은 템플릿 일치12,13,15,29입니다. 템플릿 일치를 사용하면 매우 효과적이고 구체적이며 직관적인 방식으로 2D패턴 인식을 할 수 있습니다. 분석가가 변환 함수 매개 변수와 적극적으로 상호 작용하여 절차를 감독할 수 있는 동안 사용자 지정된 임계값 및/또는 제약 조건 함수를 적용하여 감도 및 특이성 측면에서 설정할 수 있습니다. 이 프로세스의 특수성은 균일한 배치의 샘플 간에 표적 및 표적 피크 정보를 교차 정렬할 수 있지만 중간에서 심한 정렬이 잘못되었음에도 불구하고 동일한 명목 조건으로 획득한 샘플 간에도 상호 정렬할 수 있는 가능성에 의존합니다. 이 작업의 장점은 분석가에게 시간이 많이 소요되는 모든 표적 분석자 식별을 보존할 수 있는 가능성과 이전 정교세션에서 대상 및 대상되지 않은 피크에 저장된 모든 메타데이터를 보존할 수 있는 가능성과 관련이 있습니다.
템플릿 일치는 계산 시간 측면에서도 매우 효과적입니다. 저해상도 MS 데이터 파일은 약 1~2Gb의 압축 된 데이터로 구성되며 고해상도 MS 분석은 단일 분석 실행당 10-15 Gb에 도달 할 수 있습니다. 템플릿 일치는 매번 전체 데이터 행렬을 처리하지 는 않지만 처음에는 템플릿 피크를 사용하여 크로마토그램 간의 보존 시간 정렬을 수행하며 템플릿의 참조와 유사성 일치를 위해 검색 창 내에서 후보 피크를 처리합니다. 심한 정렬 불량의 경우 가장 어려운 상황인 글로벌 2차 다항제 변환은 현지 방법보다 더 잘 수행된 동시에 계산시간(13)을줄입니다.
GC×GC 기술이 학계 및 연구 실험실을 넘어 널리 퍼지기 위해 데이터 처리 도구는 시각화 및 크로마토그램 검사를 위한 기본 작업을 용이하게 해야 합니다. 별술의 식별은 표준화 된 알고리즘 및 절차 (예 : NIST 검색 알고리즘 및 IT 교정)를 채택 할 수있는 가능성을 제공해야합니다. 상호 비교 분석은 직관적이고 효과적이며 대화형 도구에서 지원되어야 합니다. 제안된 접근 방식은 이러한 요구를 해결하는 동시에 분석용 복제, 다중 분석 결과 보정, 그룹 유형 분석 및 병렬 감지 정렬과 같은 복잡한 상황을 처리하는 고급 옵션과 도구를 제공합니다.
참조된 문헌은 GC×GC, 보다 일반적으로 포괄적인 2차원 크로마토그래피가 단일 실행 분석에서 1D크로마토그래피를 달성할 수 없는 고유한 솔루션과 신뢰할 수 있는 결과를 제공하는 많은 가능한 시나리오를 잘 다룹니다. 5,32,33 GC×GC는 분리 능력과 감도를 높이는 가장 강력한 도구이지만 분리 전력, 감도 및 기타 전신 용량에는 항상 제한이 있습니다. 이러한 시스템 제한이 접근함에 따라 데이터 분석이 점점 더 어려워집니다. 따라서 연구 개발은 분석 도구를 지속적으로 개선해야 합니다.
The authors have nothing to disclose.
연구는 프로게토 아거에 의해 지원되었다 – 폰다지오니 라 라이스 르카 농업 수레 당 rete에. 프로젝트 약어 바이올린 – 혁신적인 분석 도구 (https://olivoeolio.progettoager.it/index.php/i-progetti-olio-e-olivo/violin-valorization-of-italian-olive-products-through-innovative-analytical-tools/violin-il-progetto)를 통해 이탈리아 올리브 제품의 용맹화. GC 이미지 소프트웨어는 프로토콜을 시연하고 테스트하려는 독자를 위한 무료 평가판에 사용할 수 있습니다.
1D SolGel-Wax column (100% polyethylene glycol; 30 m × 0.25 mm dc × 0.25 μm df). Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. | Trajan SGE Analytical Science, Ringwood, Australia | PN 054796 | Carrier gas helium at a constant nominal flow of 1.3 mL/min. Oven temperature programming set as follows: 40°C (2 min) to 240°C (10 min) at 3.5°C/min. |
2D OV1701 column (86% polydimethylsiloxane, 7% phenyl, 7% cyanopropyl; 1 m × 0.1 mm dc × 0.10 μm df) from . | Mega, Legnano, Milan, Italy | PN MEGA-1701 | |
Automated system for sample preparation: SPR Autosampler for GC | SepSolve-Analytical, Llantrisant, UK | ||
Extra Virgin Olive oils: Sicily and Tuscany, Italy | Project VIOLIN (Ager – Fondazioni in rete per la ricerca agroalimentare) | Samples (n=10) were collected during the production year 2018 within the "Violin" project sampling campaign. Oils were submitted to HS-SPME to sample volatiles according to a reference protocol validated in a previous study of Stilo et al.14 | |
Gas chromatograph: Model 7890B GC | Agilent Technologies Wilmington DE, USA | ||
GC Image GC×GC edition V 2.9 | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
Image processing software | GC Image LLC, Lincoln, Nebraska | https://www.gcimage.com/gcxgc/trial.html | |
Mass spectrometer: BenchTOF-Select | Markes International Llantrisant, UK | ||
Methyl-2-octynoate (CAS 111-12-6) | Merck-Millipore/Supelco | PN: 68982 | |
Modulator controller: Optimode v2.0 | SRA Intruments, Cernusco sul Naviglio, Milan, Italy | ||
Modulator: KT 2004 loop type | Zoex Corporation Houston, TX, USA | ||
MS library and search software: NIST Library V 2017, Software V 2.3 | National Institute of Standards and Technology (NIST), Gaithersburg MD | https://www.nist.gov/srd/nist-standard-reference-database-1a-v17 | |
n-alkanes C8-C40 for retention indexing | Merck-Millipore/Supelco | PN: 40147-U | |
n-hexane (CAS 110-54-3) gas chromatography MS SupraSolv | Merck-Millipore/Supelco | PN: 100795 | |
Solid Phase Microextraction fiber | Merck-Millipore/Supelco | PN 57914-U | |
α- /β-thujone (CAS 546-80-5) | Merck-Millipore/Sigma Aldrich | PN: 04314 |